常春油麻藤花中抗氧化活性成分的提取分离

DISSERTATIONSUBMITTEDTOZHEJIANGGONGSHANGUNIVERSITYFORMASTERSDEGREEOFENGINEERINGEXTRACTIONANDSEPARATIONOFANTIOXIDANTCO田0NENTSINTHEFLO僵ROFL犯厂C助蹦AUTHORHUICHENMAJORFOODSCIENCESUPERVISORPROFQIZHENDUJAN2010COLLEGEOFFOODSCIENCEANDBIOTECHNOLOGY,ZHEJIANGGONGSHANGUNIVERSITYHANGZHOU，310035，PRCHINA常春油麻藤花中抗氧化活性成分的提取分离摘要IIIIIIIILLLLILLLLIIIIIY1721539常春油麻藤属于豆科油麻藤属，其藤茎、花和种子作为中药在我国已有数百年的药用历史。但是长期以来，由于对其认识不够，没有对其做深入的研究。目前它主要也是作为观赏植物被人们研究。有关常春油麻藤花化学成分的研究报道较少，为进一步揭示常春油麻藤花的化学成分，开发其活性成分，本试验对常春油麻藤花的抗氧化活性成分及其生物活性进行了研究。常春油麻藤花用95乙醇提取，浓缩后的水溶液用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇分配萃取，得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物用于化学成分的分离。采用DPPH法和邻苯三酚自氧化法初步测定了四种提取物的抗氧化活性，发现乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物的抗氧化活性较强，故主要针对这两相提取物进行分离。乙酸乙酯提取物采用溶剂系统TBME一甲醇水21L，V，通过柱容积为1200ML的高速逆流色谱仪分离，得到馏分AH，分别测定了它们的抗氧化活性，为进一步分离纯化提供参考；各馏分通过制备型高效液相色谱纯化，得到单体I、单体II、单体III、单体IV和单体V。抗氧化活性测定表明单体I、II和V是主要的抗氧化活性成分，单体III和IV有一定的抗氧化活性。浙江工商人学硕士研究生毕业论文正丁醇提取物采用溶剂系统正丁醇TBME水415，V、，分离得到馏分IO，通过制备型高效液相色谱纯化，馏分M得到单体VI，馏分N得到单体VII和VIII，馏分O得到单体IX。抗氧化活性测定表明单体VI、VII、VIII和IX有一定的抗氧化活性。运用质谱和核磁共振技术对9个化合物的结构进行了鉴定，它们是槲皮素3O13一D一葡萄糖苷IOHO二氢槲皮素IIOHCOLOH对羟基苯甲酸IIILI浙江工商大学硕上研究生毕业论文CH3COOH4一甲氧基肉桂酸IVOHO山奈酚V异夏佛塔苷VIOHOH山奈酚3OQL一鼠李糖基16BD一半乳糖苷】VIIIIIOI浙江工商大学硕士研究生毕业论文HOOH山奈酚3OBD葡萄糖基一14QL鼠李糖苷VIII对羟基苯甲酰葡萄糖IX以上9种化合物均为首次从常春油麻藤花中分离得到。本研究的结果可以为常春油麻藤花活性成分的筛选以及常春油麻藤的开发利用提供科学依据和技术手段。关键词常春油麻藤花；抗氧化活性；高速逆流色谱；分离；结构鉴定浙江工商人学硕上研究生毕业论文EXTRACTIONANDSEPARATL0N0FANTIOXIDANTCO咿0NENTSINTHEFLO、EROF狄C【助幽ABSTRACTMUCUNASEMPERVIRENSBELONGSTOLEGUMINOSAEMUCUNAFAMILYITSRATTAN，FLOWERANDSEEDHAVEBEENUSEDASCHINESETRADITIONALMEDICINEFORHUNDREDSOFYEARSBUTLESSRESEARCHINVOLVETHECHEMICALCONSTITUENTSINTHEFLOWEROFMUCUNASEMPERVIRENSINORDERTOINVESTIGATETHEACTIVECOMPONENTSINTHEFLOWEROFMUCUNASEMPERVIRENS，THEANTIOXIDANTSCONSTITUENTSWEREINVESTIGATEDINTHEPRESENTSTUDYTHEFLOWEROFMUCUNASEMPERVIRENSWASEXTRACTEDWITH95ETHANOL，PARTITIONEDWITHPETROLEUMETHER,ETHYLACETATE，CHLOROFORMANDNBUTANOLAFTERTHEEXTRACTIONSOLUTIONWASCONCENTRATEDTOYIELDPETROLEUMETHEREXTRACT，ETHYLACETATEEXTRACT，CHLOROFORMEXTRACTANDNBUTANOLEXTRACTWHICHWEREUSEDFORTHEASSAYOFANTIOXIDANTACTIVITYTHEEXPERIMENTSOFSCAVENGINGDPPHFREERADICALAND02。FREERADICALOFTHEFOUREXTRACTSSHOWEDONLYETHYLACETATEEXTRACTANDNBUTANOLEXTRACTPOSSESSEDANTIOXIDANTACTIVITYTHEREFORE，ETHYLACETATEEXTRACTANDNBUTANOLEXTRACTV浙江工商大学硕土研究生毕业论文WERESUBJECTEDTOSEPARATETOFINDTHECOMPOUNDSETHYLACETATEEXTRACTWASSEPARATEDBYHIGHSPEEDCOUNTERCURRENTCHROMATOGRAPHYHSCCOWITHABIPHASICSOLVENTSYSTEMCOMPOSEDOFTBMEMATHANOLWATER211，VTHEHSCCCSEPARATIONYIELDEDCOMPONENTSAHPOSSESSINGANTIOXIDANTACTIVITYTHENTHECOMPONENTSWERESUBJECTEDTOPREPARATIVEHPLCSEPARATION，WHICHRESULTEDINQUERCETIN3O13一DGLUCOPYRANOSIDEI，DIHYDROQUERCETINII，4HYDROXYBENZOICACIDIII，EPMETHOXYCINNAMICACIDIVANDKAEMPFEROLV，INWHICHCOMPONENTSI、IIANDVPOSSESSINGHIGHERANTIOXIDANTACTIVITYNBUTANOLEXTRACTWASSEPARATEDBYHSCCCWITHABIPHASICSOLVENTSYSTEMCOMPOSEDOFNBUTANOLTBMEWATER415，VVTHEHSCCCSEPARATIONYIELDEDCOMPONENTSI0POSSESSINGHANTIOXIDANTACTIVITYTHENTHECOMPONENTSWERESUBJECTEDTOPREPARATIVEHPLCSEPARATION，WHICHRESULTEDINISOSCHAFTOSIDEVI，KAEMPFEROL3OQLRHAMNOPYRANOSYL一16一13一DGALACTOPYRANOSIDE】VII，KAEMPFEROL一3一O一13一DGLUCOPYRANOSIDE一14一QLRHAMNOPYRANOSYL】VIIIAND1一4一HYDROXYBENZOYL一GLUCOSEIXTHEYALLHAVESOMEANTIOXIDANTACTIVITYTHEABOVESTUDIESDEMONSTRATETHATANTIOXIDANTCOMPOUNDSOCCURINTHEFLOWEROFMUCUNASEMPERVIRENSQUERCETIN3OBDGLUCOPYRANOSIDE，DIHYDROQUERCETINANDKAEMPFEROLARETHEMAINVL浙江工商大学硕士研究生毕业论文FUNCTIONALCOMPOUNDSKEYWORDSTHEFLOWEROFMUCUNASEMPERVIRENS；ANTIOXIDATIONACTIVITY；HSCCC；SEPARATION；IDENTIFICATIONHOOHQUERCETIN3OBDGLUCOPYRANOSIDEIOHODIHYDROQUERCETINIIOHIOH4HYDROXYBENZOICACIDIIIV儿OSIDE浙江T商大学硕士研究生毕业论文OKAEMPFEROL3O13一DGLUCOPYRANOSIDE14QLRHAMNOPYRANOSYLVHOL，4一HYDROXYBENZOYL一GLUCOSEIXH浙江工商人学硕士研究生毕业论文X浙江T商大学硕十研究生毕业论文目录第1章前言111常春油麻藤简介L12国内外研究现状213抗氧化与自由基3131自由基3132自由基对生物人分子的损伤4133自由基0疾病、衰老5134天然抗氧化物质的研究与开发714本课题研究的意义和内容10第2章常春油麻藤花化学成分的提取及初步抗氧化活性研究1321化学成分的提取13211原料13212仪器与试剂13213实验方法13214结果与讨论1422各部分提取物的初步抗氧化活性研究14221材料14222方法15223结果与讨论1623小结18第3章乙酸乙酯提取物抗氧化活性成分分离1931高速逆流色谱分离抗氧化活性成分19311实验材料19312实验方法20313结果与讨论2232制备型高效液相分离抗氧化活性成分25I浙江工商人学硕上研究生毕业论文321方法26322结果与讨论2633小结33第4章正丁醇提取物抗氧化活性成分分离3541高速逆流色谱分离抗氧化活性成分35411实验材料35412实验方法35413结果与讨论3642制备犁高效液相分离抗氧化活性成分39421方法39422结果与讨论4043小结45第5章结构鉴定4751材料与方法47511材料47512方法4752结果与讨论47521化合物I47522化合物II49523化合物III50524化合物51525化合物V52526化合物53527化合物56528化合物57529化合物6053小结60第6章总结61参考文献63附图69IL浙江T商大学硕士研究生毕业论文第1章前言11常春油麻藤简介常春油麻藤MUCUNASEMPERVIRENS男JIJ名常春黎豆藤，豆科LEGUMINOSAE，油麻藤属MUCUNA【11。为亚热带、温带常绿阔叶藤本植物，喜光，喜温暖温润气候，适应性强，耐阴，耐干旱，耐瘠薄，对土壤要求小严，喜深厚、肥沃、排水良好的土壤12J。在我国四川、贵州、云南、陕西南部秦岭南坡、湖北、浙江、湖南、福建、广东、广西等长江以南诸省区均有自然分布【3J。常春油麻藤属高大木质藤本，长达25M，老茎直径达30CM；树皮峰硬，多皱纹；幼茎有突起的纵脊与突起的褐色皮孔；光滑无毛。三出羽状复叶，小叶无毛，顶生D,【RT狭或宽椭圆形；总状花序，长10“36CM，有分枝57；萼宽钟形，花蝶形，花冠深紫色或淡红色，荚果木质，条形，密被红褐色毛，长30“60CM，宽25“35CM，厚113CM，种脐黑色，包围种子工34。花果期45剧引。常春油麻藤是一种优良的药用植物和观赏植物。在我国，常春油麻藤被作为中药鸡血藤使用而在书中有所记载。本草备要中载有中药鸡血藤。植物名实图考中也有关于鸡血藤的记载。常春油麻藤全株可供药用，有活血化瘀，舒筋活络之效。其藤茎和种子一直作为中药在民间使用。性温，味苦，具有行血活血、通经活络之功效，主治关节风湿痛、跌打损伤、血虚、月经不调及经闭【41。经民间长期使用后反映该药通经活络、补血作用类似鸡血藤，但侧重于滋补强壮而不腻，I1感还优于鸡血藤15J。至今在中医药领域也可时常见到常春油麻藤被作为鸡血藤进行药用探讨【6。又因其种子与少常用中药刀豆外形较相似，民间时有误用，王疏梅等【81特对二者进行了性状、显微及理化方面的比较鉴别。常春油麻藤为油麻藤属植物目前在绿化中较常见的种类。其形态特征和生态学特征以及分布特点，都证明它是一种园林价值很高的垂直绿化植物，既有良好浙江工商大学硕上研究生毕业论文的观赏性，又是绿化和防止环境污染的优良植物，对有害气体也有较强的吸附能力和净化能力。常春油麻藤可防暑降温，吸滞尘埃，减少噪音，净化空气。刘光立等【9】以爬山虎、油麻藤、木香、紫藤为材料测定这几种垂直绿化材料吸收S、CL等有害污染的生态学效应，结果表明油麻藤吸S、吸CL功能最强。其通过播种、扦插、压条、嫁接都可进行繁殖【LO】，对环境的适应性强，在不同的气候条件下，均有较高的生长量【111。上海植物园从1994年开展垂直绿化研究课题，研究中从浙南山区引种了常春油麻藤的野生种质，现已成为上海应用最广的常绿藤本之一；作为一种优良速生种质，在使用中当年最大生长量为23M，三年达到56M；当年墙面覆盖率多数达到了8095，做到了当年见效II21。常春油麻滕枝叶浓密，四季常绿，利用它可以遮掩垃圾场、厕所、车库、水泥墙、护坡等，减少夏季的辐射热，且其花序下垂数尺，形状独特，实为奇丽，老茎古朴苍劲，盘石穿缝，生势顽强，能形成独特的景观。亦可整形成不同形状的景观灌木。因其生命顽强，能盘树缠绕、攀石穿缝，也可在园林中用于山岩、叠石、林问配置，颇具自然野趣。该树种可在长江以南地区推广种植【L引。随着生活水平的提高和可绿化的面积的减小，人们越来越需要在自己周围建造一个清新整洁，优美而富有情趣的环境，不仅需要平面绿化，还需要垂直绿化与其有机结合起来。利用攀缘植物进行垂直绿化是拓展绿化空间，增加城市绿量，提高整体绿化水平和改善生太环境的重要途径。常春油麻藤可攀附建筑或其它物体，在02MXO5M的狭窄地面就能扎根生长【L们。在绿化面积不足、不便绿化的地方，常春油麻藤可以大显身手，起到见缝插绿的效果。此外，常春油麻藤的茎皮可织草袋及制纸；块根可提取淀粉；种子可榨油。12国内外研究现状目前国内外对油麻藤属植物的分类尚存在争议。争议的主要有两点，一是油麻藤属是属于豆科还是蝶形花科。在中国植物志1995141和浙江省植物志1992【11中，油麻藤属属于豆科。而在中国树木志1985151和中国高等植物1999161中，油麻藤属则属于蝶形花科。二是油麻藤属MUCUNA和黧豆属STIZOLOBIUM两者之间的关系。国外有人从油麻藤属和黧豆属这两属植物的种子存在较大差异出发，认为应将黧豆属作为和油麻藤属同等并列的属级单位，或作2浙江工商人学硕士研究生毕业论文为油麻藤属的一个亚属来处理【I71，中国高等植物也认为两者应该并列，但国外也有人从这这两属植物形态相似出发，认为两者具有相同的定义范畴，应将油麻藤属并入黧豆属【181，而在中国树木志1985中，只列有蝶形花科油麻滕属，而把黧豆属植物并入油麻藤属中。目前，常春油麻藤主要作为观赏植物被人们研究。姚东艳等阐述了常春油麻藤的形态特征、生态学特征，分析了其开发应用价值，并介绍了繁殖栽培技术。何铮呋等111I对常春油麻滕的物候节律进行了研究，发现其在昆明生长良好，对水热条件要求不高。陈柯等19,201对常春油麻藤等3种藤本植物进行了抗旱性生理指标研究，测定了干旱胁迫下常春油麻滕的生理指标，并以中华常春藤和扶芳藤为对比材料，比较分析了常春油麻藤的抗旱性和光合特性。国内外对常春油麻藤及油麻滕属植物，理生化及药用有效化学成分方面的研究报道较少。DAXENBCHLER从常春油麻藤种子中提取到了左旋多巴LDOPA，并测得其含量为67，是左旋多巴的主要提取物12J。左旋多巴是目前治疗帕金森病中枢神经系统变性疾病的首选药【211。张凌等【4】以芦丁为指标，用NAN02AIN033NAOH显色体系作为显色剂，用正交实验法研究了提取常春油麻藤中总黄酮的最佳工艺条件，并在最佳工艺条件下测得常春油麻藤中总黄酮的含量为1243。周红等F221经过盐析、离子交换及凝胶过滤，从常春油麻藤种子中纯化了A型血专一性的凝集素MSL，并进行了相关性质的研究。对于油麻藤属植物，SCHUCH23】对巴西油麻藤属植物MFLAGELLAPESTVOGEL，MIMBRICATA和巴西黧豆属植物SALERRIMUMPIPERTRACY,SPRURTENTSPERS的脂肪酸分析中发现黧豆属植物种子中油酸含量明显低于亚油酸，而油麻藤属植物中二者含量较为接近。胡旺云等【24】采用硅胶柱层析和HPLC法，从大果油麻藤的乙醇提取物的乙酸乙酯相中，分离得到7个化合物，其中二十五烷酸O【单甘油酯为新化合物，二十四烷酸O【一单甘油酯和二十六烷酸0【一单甘油酯作为天然产物首次从植物中分得。另外，有文献报道，常春油麻藤中主要含有黄酮类成分，如刺芒柄花素、大豆黄素以及3，7羟基6甲氧基二氢黄酮等【251。黄酮化合物具有降血糖、降血脂、抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、消除体内自由基等药理作用。13抗氧化与自由基131自由基浙江工商大学硕士研究生毕业论文所谓自由基FREERADICAL是指含有孤立的不成对价电子的原子或原子基团。在机体内，共价键断裂时，如果共用电子对均匀地分属两个原子或原子基团，从而产生含奇数电子的离子，就是自由基。在正常的生命过程中自由基为维持生命所必需，但自由基也是生物大分子、细胞和生物组织的危险杀手。对正常的生理情况，体内自由基不断地产生，也不断地被抗氧化剂如人体内的维生素C、维生素E、嘌呤、核苷、核苷酸等所清除，使之维持在一个正常的生理水平上，过多或过少都会给机体造成损伤F26】。在某些病理情况下，自由基会打破身体固有的平衡状态，它们攻击细胞，使其中的脂肪变质、令蛋白质“锈化”、刺穿细胞膜并破坏基因密码，最后使整个细胞功能失调、癌变、衰老以至于死亡。人体内最容易受自由基破坏的是蛋白质和脂肪分子，它们在细胞的外膜结构和血液中含量丰富，自由基会将它们氧化，令其变质。132自由基对生物大分子的损伤由于自由基高度的活泼型与极强的氧化反应能力，能通过氧化作用来攻击所遇到的任何分子，使机体内大分子物质产生过氧化变性、交联或断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体组织损害和器官退行性变化。1321自由基对核酸的损伤核酸，尤其是DNA在生物学和医学中起着十分重要的作用，它带有生物信息编码，能够控制多种生物功能，包括蛋白质的合成和遗传的性状等27,28。自由基对核酸的损害主要是对DNA的损伤。自由基可引起DNA解聚、链断裂、碱基破坏、使核酸结构发生种种破坏291。具体有六种形式双链或单链断裂；姊妹染色单体交换；DNADNA或DNA蛋白质交联；损伤后的碱基既可插到碱基序列中，也可脱下来；去甲基化。在核酸中胸腺嘧啶碱基及嘌呤基双键均可与羟自由基产生加成或脱氢反应，自由基可使核酸及其组分之间进一步进行链锁反应而产生共价连接键，导致核酸伤害，或导致遗传突变，致使DNA永久损伤，产生染色体破坏和细胞死亡等严重后果【29】。1322自由基对蛋白质的损伤自由基对蛋白质的主要作用就是修饰氨基酸残基，引起结构和构象的改变，造成肽链断裂、聚合、交联等损伤【30】。蛋白质自身或组成蛋白质的氨基酸都是活4浙江工商人学硕士研究生毕业论文性氧攻击的靶分子。蛋白质中有些氨基酸特别容易受到攻击，攻击后它们就变成其它的成分，如精氨酸会变成谷氨酸半醛，赖氨酸会变成2氨基己二酸半醛等等，使蛋白质的结构发生很大的变化【28】。1323自由基对生物膜的损伤自由基对生物膜的损伤主要是攻击生物膜上的不饱和脂肪酸PUFA而发生脂质过氧化反应，其结果是导致PUFA的断裂、氧化并产生有毒性的ROOH和其他代谢中间产物，其反应的终产物丙二醛MDA可以和膜上的蛋白、磷脂上的氨基交联生成西夫SHIF碱，导致细胞变形性改变，生物膜活性降低，从而影响膜的物理化学性质，使细胞的多种功能受到损害【3L】。133自由基与疾病、衰老生物分子受损后产生更多的活性氧，活性氧是氧分子还原成水时产生的许多活性中间体的统称，包括超氧阴离子自由基、羟自由基，过氧化氢等132】。活性氧能破坏各种生物大分子，这些分子损伤后会反过来促进活性氧的产生，形成恶性循环。生物损伤的结果既可以直接引起多种病变，又可以促进活性氧的进一步产生。1331自由基与癌症肿瘤是当今医学中占第一位的研究领域，其与自由基引起的膜脂质损伤有关。虽然目前致癌的基因和机理还不十分清楚，但自由基特别是活性氧的促癌作用日益受到重视。SZENTGYORGYI早就指出只有需氧的高级生物才患癌，因此癌与氧之间必有某种关系。现己发现癌变的两个阶段诱癌与致癌都有氧自由基的参与。在诱癌阶段，活性氧如超氧自由基和羟自由基，既可直接损伤DNA，也可以通过脂类过氧化而间接损伤DNA，而脂类过氧化作用的产物既能致癌，也能致突变。在致癌阶段，致癌剂能间接地使DNA损伤，因此致癌剂能使细胞产生有机过氧化物等活性氧，然后通过这些活性氧去攻击DNA。自由基和脂质过氧化物很容易和DNA在碱基位置上形成共价结合，对碱基进行修饰，使核糖氧化、碱基丢失、DNA链断裂、与蛋白质交联等，从而诱发基因突变或癌变3335】。1332自由基与心脑血管疾病高血脂、高血压、糖尿病、低水平的高密度脂蛋白胆固醇、高水平的低密度脂蛋白胆固醇是引发心脑血管疾病的主要诱因，多数心血管疾病都可能起因于自浙江工商人学硕上研究生毕业论文由基作为细胞损伤的介质。大量研究显示，氧化应激的增强在动脉粥样硬化的起始阶段起着关键性作用，自由基和脂质过氧化是其主要原因。自由基、脂质过氧化物对于血管壁细胞具有毒性作用。实验动物和患者的血液中自由基水平以及脂质过氧化物浓度的增加，某些血液成分容易被自由基、脂质过氧化物攻击和修饰，而修饰后这些成分致动脉粥样硬化作用更强【36，371。1333自由基与其他疾病目前研究结果揭示的证据表明，氧自由基几乎和人类常见的几种主要疾病都有关系。在神经系统，早老性痴呆症、震颤麻痹症、癫痫等疾病都有氧自由基的参与；在循环系统，动脉粥样硬化、血栓的形成、心肌缺血再灌注损伤的发病过程中氧自由基起着重要作用；肝炎和糖尿病与氧自由基密切相关；致癌、促癌和癌的形成的每一步都有氧自由基的产生与参与；白内障的形成和视网膜的损伤是氧自由基和脂质过氧化的直接作用的结果；在免疫反应的炎症中，巨噬细胞呼吸爆发释放大量氧自由基F384。1334自由基与衰老衰老是生命过程中的正常现象，近来国内外致力于衰老问题研究的学者同益增多。衰老问题是一涉及面很广的学科，从不同侧面研究生命衰老过程，形成了衰老的衰老的自由基学说、有害物质积累学说、内分泌功能减退学说、器宫功能减退学说、衰老的免疫学说、大分子交联学说、衰老的基因学说以及微量元素学说等多种学说，而其中衰老的自由基学说日益受到人们的重视。1956年HARMAN提出衰老的自由基学说。1972年，HARMAN又阐述了线粒体的功能和衰老的关系。此后又提出了线粒体衰老的概念。该学说认为机体的基础代谢和平均寿命的高低、线粒体的老化、免疫功能的降低及一些老年性疾病的发生都与自由基密切相关42,43】。机理是衰老和呼吸链生成氧自由基引起线粒体损伤。同时线粒体漏出的氧自由基及氧自由基生成的其他活性氧进一步引起包括DNA和脂质在内的其他亚细胞器成分的损伤。一般来说，老年人与老龄动物的血清中脂质过氧化产物丙二醛含量增加而SOD的活性降低。许多研究也证实，体内自由基含量是随着年龄增长而积累的，但体内产生抗氧化剂和氧化酶能力却随年龄逐渐下降44,451J1这种自由基代谢失衡现象从生命早、中期就己开始。因此，具有抗氧化活性的药物可减少自由基对机体的损伤，延缓衰老的过程。HANMAN曾用抗6浙江工商人学硕上研究生毕业论文氧化剂作为食物添加剂，明显延长了小鼠的平均寿命。134天然抗氧化物质的研究与开发抗氧化剂是指用以提供电子、抑制氧化，通过吸收自由基，而使目标物质不受攻击，但自身却相对稳定的一些化学的或具有生物活性的有机物质【4酬。抗氧化剂被广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。抗氧化剂一般分为2大类，合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。目前应用最广的为合成抗氧化剂，由于它价格低廉而广泛采用，主要有BHT、BHA、TBHQ等，但是近年来发现很多合成的抗氧化剂在一定的条件下有毒性和诱变性，从而引起人们对其的不安全感，因此，越来越多的国家开始限制或禁止使用某些合成抗氧化剂，目前日本己禁止使用BHA，美国己禁止使用BHT。而天然抗氧化剂往往具有高效低毒的特点，因此人们开始寻找高效低毒、无毒副作用的天然抗氧化剂，但是它价格昂贵，使其广泛的应用受阻，因此寻找高效低毒、价格低廉的抗氧化剂成为国内外研究发展的趋势，也足当前自由基生物学的前沿课题。现阶段研究的天然抗氧化剂包括中草药、微量元素、微生物制剂等，其中，中草药及其方剂是研究最多的领域。1982年ZNATANI掣471从迷迭香干叶中分离出三种酚系二菇化合物迷迭香酚、表迷迭香酚和异迷迭香酚，它们对猪油和亚油酸都有强的抗氧化能力，尤其对猪油的抗氧化能力是BHT和BHA的4倍。此后关于迷迭香中抗氧化活性成分的研究陆续有人报道【48】。刘玉鹏等人【49511采用乙醇三氯甲烷21作溶剂，对选定的30种中草药进行提取，并用烘箱法和OSI法测定了提取物的抗氧化活性；魏安池等【521研究了56种植物原料的抗氧化性能；李琳网等研究了三种中草药的乙醇和水的浸提物在卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系中的抗氧化活性，并比较了对羟自由基和氧自由基的清除能力；佘世望等【54J采用硫佩酸铁法，以茶多酚为对照，对60种药食两用植物进行了抗氧化活性比较，发现有55种具抗氧化活性，有20种活性较强，其中昆布、丁香、香猪、白果、小茵香的乙醇粗提物的抗氧化活性与200PPM的茶多酚相当。众多抗氧化剂的抗氧化活性是由植物体内所含的化学成分决定的，若依据抗氧化活性成分的结构差异来分类，天然植物抗氧化剂可分为黄酮类、多酚类、醌类、蛋白质类以及维生素、植酸等几大类【551。7浙江丁商大学硕十研究生毕业论文1341黄酮类黄酮类化合物主要指以2一苯基色原酮为基核的化合物，即以C6一C3C6为骨架，具有不同取代情况酚羟基的一类化合物。位于分子中心的0【、D不饱和吡喃酮使其表现出一定的抗氧化活性。这类化合物在自然界中分布极其广泛，以游离的甙原或与糖等结合的甙的形式存在。主要分为八大类，即黄酮FLAVONES、黄酮醇FLAVONOLS、黄烷酮FLAVANONES、异黄酮ISOFLAVONES、黄烷醇FLAVANOLS、黄烷酮醇FLAVANONOLS、查耳酮CHALCONE及花色素ANTHOEYANIDINS。黄酮类化合物所具有的保健功能经多位学者的研究主要表现在清除体内自由基、舒张血管、抗癌、抗病毒、抗菌消炎、抗过敏、产生痛细胞血管阻断素、刺激免疫系统产生抗体、抑制磷脂酶、脂肪氧化酶、环加氧酶、黄嘌呤氧化酶等酶的活性561。因此，对植物来源的黄酮类化合物研究成为研究焦点。目自已从节果、茶、葡萄酒等食品中鉴别分离出表儿茶素、儿茶素、柚皮苷、山奈素、槲皮素、杨梅黄素等黄酮类化合物【5。水飞蓟果中含有水飞蓟素、3氧化黄喇水飞蓟素、异水飞蓟素等，以水飞蓟素的抗氧化活性最强。黄岑中含黄芬贰、黄苏黄素、汉黄琴黄素7糖苷、汉黄苏黄素、黄琴新素等，足具较高抗氧化活性的黄酮成分。从大豆中提取分离的异黄酮也是理想的天然抗氧化剂。1342茶多酚类茶叶，在我国有千百年的饮用史，我国古籍上记载茶有61种保健作用3120余种药用功能。从茶叶中提取的主要抗氧化物质被鉴定为各种多酚类物质，简称为茶多酚。茶多酚是一类以儿茶素类为主体的多酚类，此外还含有黄烷醇类、黄烷酮、酚酸和花色甙等成分。茶多酚的抗氧化能力高于维生素E10_20倍。对于茶多酚的抗氧化和其他生物活性的研究也己经做了大量的工作，在对红茶、绿茶等深入系统的研究基础上，分离出了一些抗氧化成分，如EQICATECHIN，EQIGALLOCATECHIN，EQICATECHINGELLATE，EQIGALLOCATECHINGELLATE等。现在茶多酚亦己成为衡量天然植物有效成分抗氧化强弱的参照物。1343醌类醌类化合物是一类具有醌式结构的化学成分，主要分为苯醌、萘醌、菲醌和葸醌四种类型。在中药中以葸醌及其衍生物尤为重要。1965年，ROBE,S和CASERIO在他们编写的“有机化学基本原理一书中就提8浙江工商人学硕士研究生毕业论文到了醌类作为自由基聚合反应的阻止剂，并提出了醌类对自由基链锁反应阻止机理的假说【581。对醌类抗氧化剂及其性能进行系统的研究则是八十年代以后的事。HO等【59J从迷迭香中分离出了一种抗氧化强度在BHA和BHT之间的新物质迷迭香醌。ZHANG等160】在美国对丹参进行了更深入细致的研究，分离了七种活性成份。翁新楚和GORDON61,621在英国也对丹参进行了较深入细致的研究，分离出八种活性成份。其中有两种是第一次用于抗氧化实验。在这八种物质中，有一种是迷迭香也存在的迷迭香醌，还有其他三种醌的抗氧化性能比BHA和BHT都强得多。并且对它各自的抗氧化性质作用较系统的研究。1344蛋白质类及酶类超氧化物歧化酶SOD通过清除超氧阴离子自由基而达到抗氧化效果。过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化酶通过清除过氧化氢和羟自由基而达到抗氧化效果。藻胆蛋白是某些藻类特有的捕光色素蛋白，其中天然别藻蓝蛋白、藻监蛋白的抗氧化活性已经被证明。谷胶蛋白也具有抗氧效果。杨立红等研究了鱼腥藻藻蓝蛋白APC的体外抗氧化能力、清除活性氧超氧离子自由摹和羟自由基的能力，以及对小鼠脂质过氧化物MDA形成的抑制能力，结果显示，一定浓度范围内不同纯度的APC均有总抗氧化能力，能明显清除超氧离子自由基和羟自由基及抑制MDA生成，且呈现一定剂量关系。阎飞等【叫设计制备了以谷胱甘肽过氧化物酶GPX、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽还原酶GR和谷胱甘肽硫转移酶GST组成的体内微型的抗氧化系统，并实验证明其在维持机体ROS正常水平方面起着非常重要的作用，能有效保护细胞免遭氧化损伤。1345维生素维生素A、C、E及其衍生物，既是食品营养素，又可作为抗氧化剂。1346植酸植酸即肌醇六磷酸酯，是从米糠、麦麸等谷类和油料种子的饼粕中分离出来的含磷有机酸，它是一种安全性高的天然抗氧剂。植酸本身就是对人体有益的营养品，植酸在人体内水解产物为肌醇和磷脂，前者具有抗衰老作用，后者是人体细胞重要组成部分。每个植酸分子可提供六对9浙江丁商大学硕士研究生毕业论文氢原子使自由基的电子形成稳定结构，从而代替被保鲜物分子作为供氧分子，避免被保鲜物氧化变质。14本课题研究的意义和内容常春油麻藤作为一味中药使用具有悠久的历史，有活血化瘀，舒筋活络之效，主治关节风湿痛、跌打损伤、血虚、月经不调及经闭。目前常春油麻藤的药用功效己得到大家的认可，但对其药用功效和化学成分的研究报道很少。且对常春油麻藤花的药用功效和化学成分的研究基本空白，人们对其认识只是停留在观赏性上。很多实验己经证明，天然抗氧化剂是很多中草药的有效成分，包括现在己经在临床使用的丹参酮，银杏叶提取物EGB761，茶多酚等，他们F在为治疗人类的心脑血管疾病中发挥着重要作用。从常春油麻藤花的乙醇提取液中萃取的石油醚相、乙酸乙酯相、氯仿相、正丁醇相，经测定，都具有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯相、正丁醇相抗氧化活性极高。但是目前国内外关于常春油麻藤花的抗氧化活性成分的分离纯化及鉴定的研究还没有报道，所以分离提取常春油麻藤花抗氧化活性成分，测定其抗氧化活性，对开发新型天然抗氧化剂具有应用价值。同时，有利于人们对常春油麻藤花化学成分的认识和了解，有利于促进常春油麻藤的进一步丌发和利用。目前对于植物内活性成分的分离提取，最常用的有柱层析法、高效液相色谱法、逆流色谱法以及采用多种溶剂反复提取法等。其中逆流色谱法因为其固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附；具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点而备受关注。本实验综合国内外对植物生物活性成分提取方法的研究，采用高速逆流色谱、制备型HPLC等对常春油麻滕花的抗氧化活性成分进行分离提取，并对得到的化合物用化学方法和光谱方法紫外可见吸收光谱、质谱、核磁共振分析鉴定它们的结构。本研究的主要内容为1、常春油麻藤花中化学成分的提取分离。常春油麻藤花预处理后用乙醇回流提取，再用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇依次萃取，得到四个相的萃取物。2、对提取出的组分进行分离纯化。采用不同的色谱方法如逆流色谱法结合制备液相色谱等手段分离纯化常春油麻藤花中的各种活性组分。LO浙江工商大学硕J研究生毕业论文3、对分离出来的单体化合物的化学结构进行鉴定。通过紫外可见吸收光谱、质谱和核磁共振氢谱、碳谱以及二维谱等谱图，进行结构解析，确定分子结构。4、对提取出来的单体化合物，采用DPPH法和邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性大小。浙江工商人学硕L上研究生毕业论文12浙江T商大学硕上研究生毕业论文第2章常春油麻藤花化学成分的提取及初步抗氧化活性研究21化学成分的提取211原料常春油麻藤花，采自灵隐飞来峰。212仪器与试剂旋转蒸发仪RE52嚣J旋转蒸发仪上海博通有限公司水浴锅WATERBATHSB2000上海爱朗仪器有限公司真空泵SHZD循环水式真空泵河南巩义市英峪豫华仪器厂冷凝装置DLSB一系列型低温冷却液循环泵郑州长城科工贸有限公司冷冻干燥机FD1冷冻干燥机JK京博医康技术公司超声波设备KQ5200型超声仪昆【IL市超生仪器有限公司电子天平AY120SHIMADZUJAPAN95乙醇AR，石油醚AR，乙酸乙酯AR，正丁醇AR均购于自华东医药股份有限公司，氯仿AR，通过学院订购；水为蒸馏水。213实验方法常春油麻藤花干品，粉碎，用95乙醇60。C浸提两次，每次浸提时间2小时。提取液减压浓缩至无醇味后，将浓缩物分散在蒸馏水中，用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取物减压浓缩得四部分浸膏。提取过程如下图所示。13浙江工商人学硕上研究生毕业论文常香油脉藤花1粉碎乙醇回流提取1L减压浓缩浸膏上石油醚萃取石油醚萃取液水相I减压浓缩I乙酸乙酯萃取石油醚相J乙酸乙酯萃取液水相1|减压浓缩1|氯仿萃取乙酸乙酯相厂氯仿萃取液水相1|减压浓缩1|丁醇萃取氯仿相土上琢LL，J，I口II丁醇萃取液水相1L减压浓缩丁醇相图21常春油麻藤花中有效成分的提取流程图FIG21THEPROFILEOFEXTRACTIONOFTHEMAINBIOACTIVECONSTITUENTSINFLOWERSOFMUCUNASEMPERVIRENS214结果与讨论上述方法提取，从45KG常春油麻藤花干品种得到石油醚浸膏279、乙酸乙酯浸膏159、氯仿浸膏LOG，正丁醇浸膏609。22各部分提取物的初步抗氧化活性研究本试验用DPPH法和邻苯三酚白氧化法评价四部分提取物的抗氧化活性。221材料2211仪器可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司。14浙江T商大学硕十研究生毕业论文水浴锅DKS16型电热恒温水浴锅上海深信实验仪器有限公司。天平SHIMADZUAYL20日本岛津。其它容量瓶1000ML，500ML，100ML，50ML，移液枪200UL，LML，移液管2ML，5ML，吸耳球，10ML具塞刻度试管，具塞试管。2212试剂DPPH苯基苦味酰基苯肼、2，2DIPHENYLLPICRYLHYDRAZYL，SIGMA，AR，抗坏血酸VC，TRIS，盐酸，邻苯三酚，无水乙醇，蒸馏水。222方法2221DPPH自由基清除率的测定DPPH二苯代苦味酰自由基是个大分子的稳定自由基抗氧化剂预期作用模式为AHDPPH,DPPHHA。DPPH是一种被广泛使用的自由基，在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，在520NM处有一个特征吸收峰，当其遇到自由基清除剂时，DPPH的孤电子被配对，使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小。因此，可通过测定吸光度的变化来评价对DPPH自由基的清除效果。本实验采用DPPH法测定样品清除自由基活性，实验方法参考65,66】，并作相应修改。01MMOLLDPPH溶液的配制称取200MGDPPH溶解于500ML容量瓶，定容，摇匀，避光保存。另将VC、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物和正丁醇提取物用无水乙醇溶液配成200、400、600、800、1000PGML的溶液备用。按表21力口反应液。表21DPPH试验加样表TABLE21DPPHTREATMENTINTESTAO2MLDPPH溶液LML50G_,醇AI2MLDPPH溶液LML样品溶液AJLML样品溶液2ML50G_,醇将AO、AI、Q所表示的样品在室温避光静置20MIN后，加入比色皿中进行吸光度的测定，测出舢、AI、AJ所表示样品的吸光度值。样品对DPPH自由基的清除能力SCAVENGINGACTIVITY，SA按式21计算SA1一AIIJAOX10021浙江工商人学硕上研究生毕业论文式中AODPPH与溶剂混合液的吸光度；AIDPPH与样品反应后的吸光度；AJ_样品与溶剂混合液的吸光度。将试验重复三次，求得清除率的平均值。2222超氧阴离子自由基02。清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法【67】，实验原理邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化，释放出，生成有色的中间产物，可用分光光度法进行测定，当有清除剂存在时，清除02，从而阻止中间产物的累积，使邻苯三酚自氧化速率降低，表现为体系的吸光度降低。实验过程将VC、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物和正丁醇提取物用无水乙醇溶液配成200、400、600、800、1000PGML的溶液备用。取50MMOLLTRISHCLPH82缓冲液28ML，加O1ML不同浓度的四种提取物，放入25预温的60MMOLL邻苯三酚01ML，充分混匀，准确反应3MIN力FI入邻苯三酚时开始计时后，加入5抗坏血酸VC005ML终止反应。10MIN后，在420NM处测定吸光度。以等体积10MMOLLHCL代替邻苯三酚溶液为空白调零，对照组以等体积纯水代替样品。按式22计算02清除率EAOAAOX10022式中E为清除率；为对照组OD值；A为样品组OD值。将试验重复三次，求得清除率的平均值。223结果与讨论2231DPPH自由基清除结果表22是各浓度VC、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物对DPPH自由基的清除率。表22常春油麻藤花提取物的DPPH自由基清除率TABLE22THESCAVENGINGRATEOFDPPHFREERADICALOFEXTRACTSOFFLOWERSOFMUCUNASEMPERVIRENS16浙江工商大学硕十研究生毕业论文图22是其在浓度100OUGML时对DPPH自由基的清除率。10080604020O彩”锡缓。么100O肛GML纱秽锶；J暾孩弱鞠缓锄搦囵LR鼍霞。缓缀籀么图22样品对DPPH的消除能力比较FIG22THECOMPARISONOFEXTRACTSOFFLOWERSOFMUCUNASEMPERVIRENSONSCAVENGING02。FREERADICAL从表22及图22可知，常春油麻藤花的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物具有较强的清除DPPH自由基的能力，在浓度100OI，TGML时，清除能力分别为VC的8784和8I57，而石油醚提取物和氯仿提取物的DPPH自由基清除能力较弱。并且清除率随样品浓度的增加，对DPPH的清除能力也随之增加，呈现良好的量效关系。2232超氧阴离子自由基02清除结果表23是VC、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物对超氧阴离子自由基的清除率。表23常春油麻藤花提取物的超氧阴离子自由基清除率垦耻E23THESCAVENGINGRATEOF02FREERADICALOFEXTRACTSOFFLOWERSOFMUCUNASEMPERVIRENS17巷氍粪浙江工商大学硕上研究生毕业论文图23是其在浓度100O“GML时对超氧阴离子自由基的清除率。100O肛GML。一。乳一阻图23样品对超氧阴离子自由基的清除能力比较FIG23THECOMPARISONOFEXTRACTSOFFLOWERSOFMUCUNASEMPERVIRENSONSCAVENGING02FREERADICAL从表23及图23可知，常春油麻藤花的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物具有较强的清除超氧阴离子自由基的能力，在浓度100OL|TGML时，清除能力分别为VC的8418和7693，而石油醚提取物和氯仿提取物的超氧阴离子自由基清除能力较弱。并且清除率随样品浓度的增加，对DPPH的清除能力也随之增加，呈现良好的量效关系。23小结提取得至0石油醚浸膏27克、乙酸乙酯浸膏15克、氯仿浸膏10克，正丁醇浸膏60克。通过研究四种提取物清除DPPH自由基和清除超氧阴离子自由基02。的作用可以得出如下结论正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物有很强的抗氧化活性，氯仿提取物和石油醚提取物的抗氧化活性均较低。故本试验主要正对乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物进行分离。18厂。LRLI卜LOOOOOOM86428M篓霹浙江工商大学硕十研究生毕业论文第3章乙酸乙酯提取物抗氧化活性成分分离31高速逆流色谱分离抗氧化活性成分逆流色谱COUNTERCURRENTCHROMATOGRAPHY是一种无固体支撑的液液分配色谱，溶质通过在不相混溶的两相溶剂相互逆流作用的过程中，根据各自分配系数的大小不断进行分配，从而达到分离效果。该色谱技术不用固相填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流穿透过程。所以能节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗，运行使用的后续投入较低，同时也消除了由于使用载体而带来的吸附现象【洲。与其他分离手段相比HSCCC具有以下优点能构成连续、自动、高效和非高压的色谱系统，其分离的效率可与高效液相色谱相比；既能用于未经严格预处理的大量粗制样品的分离，又能用于高纯度单体的分离；能有效地分离强极性的组分；仪器设备简单、价廉、操作方便、样品无损耗或沾染、溶剂用量少、处理样品大；操作条件温和，能够用于不稳定成分的分离等优点【68,69】。正因为高速逆流色谱具有这些优点，使其特别适用于制备性分离。现在国外已被广泛应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机化学、环境分析、食品、地质、材料等领域。311实验材料3111仪器高速逆流色谱仪HSCCCD1200自行研制分析型高效液相色谱仪SHIMADZU，JAPANODSBPA，150X46MMID。制备型高效液相色谱仪JAILC9103，JAPANODSBP30，250X30MMID。自动部分收集器BSZ100自动部分收集器上海沪西分析仪器厂旋转蒸发仪I也一52型