现代生物分析技术1

1、现代生物分析技术,主要内容,样品分析前处理 仪器分析基础 色谱法基础 气相色谱法 高效液相色谱法 质谱分析法 色谱质谱联用,待分析的对象中除了含有目标化合物，通常还包括各种原材料、添加剂、辅料及杂质等。样品种类繁多，成分复杂，来源不一，分析的目的，项目和要求也不尽相同，但无论哪种对象，都要按一个共同程序进行一般为：,第一章 样品分析前处理,1.1 样品采集 1.2 样品保存 1.3 样品前处理,1.1 样品采集,定义：从大量的分析对象中抽取有代表性的一部分作为分析材料 (分析样品)，这项工作称为样品的采集，简称采样。 样品类型：固体、液体、气体样。,准确取样原则,1）采集的样品必须具有代表性；

2、 2）采样方法必须与分析目的保持一致； 3）采样及样品制备过程中设法保持原有的理化指标，避免待测组分发生化学变化或丢失； 4）要防止和避免待测组分的沾污； 5）样品的处理过程尽可能简单易行，所用样品处理装置尺寸应当与处理的样品量相适应。,采样方法,一、随机抽样 均衡地，不加选择地从全部样品的各个部分取样，要保证所有物料各个部分被抽取的可能性均等。 二、代表性抽样 按不同日期；可在流水线上按时间间隔取样；按分析目的取样等。,固体样品的制备,分为样品的粉碎、混匀、缩分等过程。 四分法：,9,液体样品如何采集？ 气体样品如何采集？,1.2 样品保存,采取的样品应在短时间内分析，否则应妥善保管。 放在

3、密闭、洁净容器内，置于阴暗处保存。 易腐败变质的放在05冰箱内，保存时间也不能太长。 易分解的要避光保存。 特殊情况下，可加入不影响分析结果的防腐剂或冷冻干燥保存。,1.3 样品前处理,在测定生物样品中的目标物（如药物及其代谢物）时，一般要在测定前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集。 主要考虑生物样品的种类，被测物质的性质和测定方法三个方面的问题。,样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。 例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出。 根据被测物的结构、理化性质、存在形式、浓度范围等，采用相应

4、的前处理方法。 样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。,样品处理的目的：,1.将待测物转化为易分析的形式； 2.去除对测定有干扰的物质； 3.对含量低的待测组分可以浓缩和富集。,样品处理方法,常见的样品处理方法主要有：A. 溶解法；B. 分解法；C. 分离法。 包括破碎、制备样品溶液、干扰成分的去除（液相和固相萃取）、浓缩、离心、冷藏等。,A. 溶解法,溶解法：是将样品中的待测组分全部溶于适当的溶剂中。 适用：各类物质（包括无机物和有机物）测定的样品处理。 可选溶剂：水、酸性水溶液、碱性水溶液、有机溶剂。,B. 分解法,分解法：是将样品中的大量有机物分解

5、破坏除去。 适用：含有大量有机物的样品中无机组分测定时的样品处理。 具体分解方法： 1）干法灰化，高温； 2）湿法消解，强氧化剂。 3）微波消解，2450MHz的微波,C. 分离法,溶剂萃取法：亲水疏水性和分配定律，可采用少量多次萃取提高萃取效率； 浸取法：索氏抽提装置； 色谱法： 薄层层析、固相萃取、凝胶色谱等； 挥发和蒸馏法：常压、减压法（如分子蒸馏）。,1. 破碎,机械法：组织匀浆机、高速组织捣碎机、高速细胞破碎机、研钵和研磨； 物理法：超声波细胞破碎机、反复冻溶法、急热骤冷法； 化学法：自溶法、酶溶法、化学渗透法。,超声波细胞破碎仪,原理：常温下采用超声波的能量使细胞在热效应、空化效应

6、、机械效应的作用下破碎，物质被均质、分散、乳化、颗粒纳米化。,2.混匀,均质机：高速剪切乳化、高压乳化 涡旋振荡器 磁力搅拌器,3.微孔膜过滤,膜滤技术是将溶液中的物质按分子大小进行分离。 纤维素膜（亲水性）、聚四氟乙烯膜（疏水性）、聚酰胺膜（通用） 微滤：0.025-14m 超滤：0.002-0.1m，水和小分子能透过 反渗透：水分子可以通过，而杂质无法通过膜 纳滤：对二价或多价离子及分子量介于200-500之间的有机物有较高脱除率,各种滤膜对溶剂的适用性,一次性注射器,针式（头）过滤器,样品瓶,样品过滤,24,液液萃取,水相,待测物A,分配系数KD,分配比D=,百分萃取率E=,用CCl4萃

7、取碘,D=85,E=98.8%,增加有机溶剂体积 多次萃取,混合液的各组分在溶剂中的溶解度(或分配系数)各不相同,4. 液液萃取,26,5. 索氏抽提装置,索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的，提取管两侧分别有虹吸管和连接管，各部分连接处要严密不能漏气。,6. 旋转浓缩仪,作用：蒸去溶剂，效率高。 原理：一是靠减压；二是靠旋转时，使溶液构成液膜，扩展蒸发面积。 氮吹仪,7. 离心机,利用强大的离心力将物理性质（如质量、浮力、沉降系数等）不同的悬浮液内微粒进行分离、浓缩的技术称为离心技术。 低速：30000 r/min,8. 冷冻干燥,冷冻干燥（冻干）：将含水物质，先冻结成固态，而后

8、使其中的水分从固态升华成气态，以除去水分而保存物质的方法。 真空冷冻干燥技术在生物工程、医药工业、食品工业、材料科学和农副产品深加工等领域有着广泛的应用。,传统的样品前处理方法及特点,液液萃取,蒸馏,索氏萃取,沉淀,离心,大量使用有机溶剂,处理时间长,操作步骤多,较大误差,影响操作人员健康,污染周围环境,样品前处理的发展趋势,减少甚至不用有毒有机溶剂； 能适应处理复杂介质、痕量成分、特殊性质成分分析的要求； 减少操作步骤； 尽量集采样、萃取、净化、浓缩、预分离、进样于一身。,9. 固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）,液固萃取法，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，广泛

9、的应用在医药、食品、环境、商检、化工等领域。 基本原理：通过颗粒细小的多孔固相吸附剂选择性地吸附溶剂中的被测物质，被测物质被定量吸附后，用体积较小的另一种溶剂洗脱或热解析的方法解析被测物质。实质上是柱色谱分离过程，机理类似于高效液相色谱（HPLC）。,固相萃取法示意图,(一) 活化吸附剂。其目的是除去吸附剂（或称萃取剂）中杂质；吸附剂溶剂化，促使样品溶液与吸附剂表面的紧密接触。 例如，反相C18固相萃取柱的预处理： 1）用适量正己烷活化吸附剂，使原C18的长链由卷曲状态变成伸展状态，使样品溶液与吸附剂紧密接触 2）用甲醇置换正己烷并充满吸附剂的微孔 3）用水或缓冲溶液顶替出柱中的甲醇。,SPE

10、操作步骤,(二) 样品吸附 选用合适的溶剂稀释试样。反相机理固相萃取水样中有机物时，以水或水基缓冲溶液为溶剂，其中有机溶剂量应50mm萃取过程中，应尽量避免柱子流干，进入气泡，否则影响萃取效率。,(三) 干扰杂质的除去 洗涤目的是除去吸附在柱子上的少量基体干扰组份。选择合适的洗涤液使干扰物除去而不流失目标物。最好先做预试验。 (四) 目标物的洗脱 关键在于洗脱溶剂的选择，极性太强在洗脱目标物的同时也会带下杂质。有时为了得到较纯的目标物，可先用极性稍弱的洗脱剂，加大使用洗脱液的体积，然后再浓缩。,高的回收率和富集倍数 回收率：70%100% 富集倍数：几百倍，几千倍或几万倍 使用有毒有害溶剂少，

11、既减少了环境污染，也减少 了溶剂中杂质对目标物的污染。 无相分离操作：易于收集待测物组份，能处理小体积试样 操作简单快速，易于实现自动化（大体积样，可用在泵压力推动下的固相萃取柱或固相萃取盘分析）,SPE萃取的特点,不同类型的固相萃取柱：柱管、烧结垫（筛板）和填料,SPE操作方式,离心固相萃取,负压SPE装置,固相微萃取（SPME）：非溶剂性萃取法，适合挥发性、半挥发性物质，主要用于环境、农药、食品饮料及生物样品的分离分析。 特点：简单、快速，可节省样品预处理70%的时间，不需要溶剂，改善工作环境；集采样、萃取、浓缩与进样一体。,10. 固相微萃取 （Solid Phase Microextr

12、action，SPME）,纤维SPME萃取装置 萃取头1-2cm长，涂有不同GC固定相或吸附剂的熔融石英纤维，由环氧树脂粘接在一根不锈钢微管上。由于石英纤维非常脆弱，外部要套一层保护作用的不锈钢针管。使用得当每根可用50次以上。,纤维涂层： 键合和非键合型 交联和非交联涂层 目前使用的多为键合和部分交联方式，这种纤维不能暴露在高浓度的有机物和强酸碱中。当样品中有机物含量高于20%，固定相会因膨胀而脱落；键合型可用于高浓度的有机物，需在GC分析时用高纯载气，痕量氧会使涂层氧化。,SPME的应用： 环境水样分析：江河、湖泊、海洋、废水、污水、地下水、饮用水、是灵敏的痕量分析技术 土壤、底泥与生物组

13、织等固体样品中的VOCs 气体分析 食品检测：添加剂，香料，酒，果汁，饮料，水果 医药卫生：人体体液分析（血、尿、乳汁等） 药品成分分析,11. 微波辅助萃取（Microwave-assisted extraction，MAE）,MAE原理：基于微波加热的方法。利用极性分子（乙醇、甲醇、丙酮或水）可迅速吸收微波能量。 操作：将样品置于聚四氟乙烯材料制成的样品杯中，加入萃取试剂，放入密封好、耐高压又不吸收微波能量的萃取罐中。 优点：密封、溶剂挥发加压，萃取溶剂沸点升高，提高萃取温度；密封，萃取溶剂不挥发，减少其用量。,开罐式聚焦微波萃取系统,12. 超临界流体萃取（Supercritical F

14、luid Extraction，SFE）,超临界流体流体的温度、压力处于临界状态以上。 SFE：利用超临界流体（SCF）作为溶剂，用来有选择性地溶解液体或固体混合物中的溶质。对溶质的溶解度大大增加。,超临界流体相图,超临界流体的特点,扩散系数大,粘度小,改变T、P可改变溶解能力,CO2超临界流体：不可燃、无毒、廉价易得、化学稳定性好。,最常用：CO2 临界温度：31oC， 临界压力：7.4MPa 苯、水、一氧化二氮,超临界流体萃取系统示意图,SFE应用,在医药方面的应用（中草药有效成分提取分离、药物分析） 在食品工业中的应用（大蒜、红辣椒、番茄等） 在香精、香料提取中的应用 在天然色素提取中的

15、应用 在环境保护方面的应用（杀虫剂、多氯联苯、多环芳烃等）,13. 单滴微萃取（single drop microextraction，SDME）,原理：单滴溶剂； 特点：它集萃取、富集于一体，具有成本低、装置简单、易于操作、有机溶剂用量少以及富集效率高等特点。,14. 加速溶剂萃取（Accelerated Solvent Extraction ，ASE）,原理：较高的温度( 150200 )和压力( 10003000 PSI)下的有机溶剂萃取法。增加压力提高溶剂沸点，增加溶解性。 特点：有机溶剂用量少、快速、基质影响小、回收率高和重现性好。,各种萃取技术比较,实例：血药分析,（一）去除蛋白质

16、 目的： 可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能，延长使用期限。,去除蛋白质的方法： 1、加入与水相互溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1:（1-3)时，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用超速离心机（10000r/min )离心便可将析出的蛋白质完全沉淀。,2、加入中性盐 盐类属强电解质，有强烈的水化作用，破坏物质原有的水化层而使之沉淀。中

17、性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。 常用的中性盐：饱和硫酸胺等。盐析的方法与有机溶剂提取法常并用，药物的回收率高。,3、加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。 常用的强酸有：10%三氯醋酸等。含药物血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质，取上清液作为样品。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。,4、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CuS04-Na2S04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血

18、清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上清液。 5.酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。,（二）缀合物的水解 尿中药物多数呈缀合状态。 含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物； 含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。 由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，常用酸水解或酶水解的方法。,酸水解时，可加入适量的盐酸液。 对于遇酸及受热不稳定的药物，可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶一硫酸酯酶的混合酶。,（三）分离、纯化与浓集

19、 1.液液提取法（liquid-liquid extraction; LLE)多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质。,应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等。 对所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大；沸点低，易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。最常用的溶剂是乙醚和氯仿等。 提取时所用的有机溶剂要适量。一般有机相与水相（体液样品）容积比为1：1或2:1。,生物样品一般多在碱性下提取，多数药物是亲脂性的碱性物质，生物样品中的内源性物质多是酸性的。 当碱性药物在碱性pH不稳定时，则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。,提取时于水相（体液样品）中加