蔡玉勇经理 益生菌和酶制剂在水产饲料中应用与研究进展 2

1、 益生菌和酶制剂在水产饲料中 应用与研究进展 报告人：蔡玉勇2016年10月23日 益生菌在水产饲料中应用 酶制剂在水产饲料中应用 存在问题与发展方向 益生菌在水产饲料中应用益生菌主要种类概述益生菌的主要作用及机理益生菌在水产饲料中应用 2013年饲料添加剂目录批准饲用益生菌Live microorganis mspermitted as feed additives29种全部养殖动物可用 2种可用于青贮饲料与牛饲料 1种可用于青贮饲料 31种微生物种批准用于水产动物，主要是乳酸菌（20种）、批准饲用活菌制 1种可用于肉鸡、生长肥育猪或水产动物 芽孢杆菌（6种）与酵母（2种）；剂（34种） 几

2、乎所有的酵母类产品被归入于2013年饲料原料目录。1种可用于肉鸡、肉鸭、猪或虾 2013年饲料添加剂目录 水产动物肠道菌群特点及作用肠道菌群结构特点 梭杆菌门、变形菌门多，拟杆菌门少 厌氧菌（ 99%）、兼性厌氧菌和好氧菌肠道菌群作用 屏障作用 营养功能 免疫调节功能 益生菌的主要作用及机理芽孢杆菌作用机理 群体感应（quorum sensing, QS）p 利用密度感应抑制技术控制水产养殖细菌害 （a） 革兰氏细菌的 QS 系统 （b） 革兰氏阳性细菌的 QS 系统 兼具上述两种群体感应特点的复杂 QS 系统 群体淬灭p QQ（quorum quenching）通过干扰微生物细胞间的QS系统

3、，阻止依赖型基因表达而防御病 原菌感染的一种现象p 群体淬灭原理 分泌某种物质（QS分解剂），破坏自诱导剂，阻止QS出现 分泌某种物质（QS抑制剂），竞争抑制自诱导剂，延缓QS出现p QQ菌：能产生QS抑制剂或QS分解剂的细菌p QQ菌特点 不产生耐受性 不直接杀灭病原菌 益生菌应用-芽孢杆菌海参饲料添加p 免疫增强剂：激活水产动物免疫力、提高抗应激能力及耐受力，促进生长刺参体腔细胞吞噬作用与呼吸爆发活性 益生菌应用-芽孢杆菌海参饲料添加刺参体腔细胞免疫基因表达 益生菌应用-芽孢杆菌海参饲料添加刺参体肠道免疫基因表达 刺参肠道形态观察中肠是营养物质吸收的场所，其吸收效率与肠道的吸收表面积有着直

4、接联系。 投喂马氏副球菌、蜡样芽孢杆菌和氟苯尼考对刺参肠道结构的影响 投喂氟苯尼考会导肠道结缔组织增生和微绒毛高度显著降低。 投喂马氏副球菌、蜡样芽孢杆菌和氟苯尼考对刺参肠道形态的影响 投喂蜡样芽孢杆菌可以显著促进刺参肠道皱褶和微绒毛的发育，而氟苯尼考的使用会导致微绒毛的萎缩。 刺参中肠肠道组织形态电镜观察 益生菌应用-肠道DGGE条带分布模式图1.2.35条条带。 4和13为共有优势菌落 对照组CT1中含有不同于其它处理组优势菌群条带26。 4和19丰度在各处理组大幅降低 24和29在处理组形成优势细菌群落为厚壁门芽孢杆菌属 3.4.5. 益生菌应用-肠道各种细菌群落的相对丰度（DGGE）1

5、..属于-变形菌纲中的细菌种类最多，有8种； -变形菌纲在对照CT1中属于优势菌群，在处理组中属于第二优势菌群； 黄杆菌纲为CT2对照的优势菌群，包含条带6、14、19和28； 芽孢杆菌纲为处理组的优势菌群，包含条带2、24、25和29； 以对照组CT2为参照，除-变形菌纲的相对含量有所增加外，其它类群的细菌都有不同程度的降低。 刺参肠道不同的细菌类群的相对丰度（0.6的临界值） 刺参肠道细菌群落主坐标分析 A: Unifrac 权重的PCoA分析。B:非 Unifrac 权重的PCoA分析。 PM、G19和FL处理组刺参肠道菌群结构均与对照组发生明显分 异。 刺参肠道细菌微生物

6、生态网络图 复合益生菌+酶制剂在对虾养殖中应用复合益生菌+酶制剂（酵）主要成分：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、淀粉酶、中性蛋白酶、糖化酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、酵母水解物等。表 1 不同添加剂对凡纳滨对虾血清非特异性免疫相关酶活性的影响指标index 处理 Treatment酸 性 磷 酸 酶ACP(金氏单位100ml)碱性磷酸酶AKP（金氏单位100ml） 超氧化物歧化酶SOD （Uml） 溶菌酶LZM一氧化氮合酶（Uml） NOS（Uml）对照 5%5.930.59 a7.830.79 b1.470.08 a2.160.11 b264.751.89 a291.5516.62 b41

7、.978.57 a94.2110.91 b12.830.61 a14.260.67 b酵注:中国海洋大学生态养殖实验室提供上图中显示的各酶活指标代表了对虾机体的免疫力强弱，酶活越高免疫力越强，按5%使用饲料伴侣-酵均提升56.18%。15d后，对虾机体的免疫力明显提高，免疫力平 复合益生菌+酶制剂在对虾养殖中应用图1 攻毒实验的累计死亡率注：中国海洋大学生态养殖实验室提供长期使用酵后，进行副溶血弧菌攻毒试验，以测定对虾的免疫力和抗病力，经过14天，对照组死亡率高达71%，而按5%使用酵实验组的死亡率仅为25%。 复合益生菌+酶制剂在对虾养殖中应用未使用酵前，对虾肠道细小不清楚；肠道绒毛稀疏使用

8、酵后，对虾肠道粗大清晰；肠道绒毛浓密 复合益生菌+酶制剂在对虾养殖中应用表1、不同的添加剂对凡纳滨对虾生长的影响（山东青岛）处理 Treatment初体重g I n i t i a l weight末体重g F i n a l weight增重率%WG特定生长率%d-1SGR饵料系数FCR对照酵1.590.04 a1.420.01 a3.510.07 a4.030.05 b121.281.85a183.21.12b1.990.02 a2.600.01b1.210.02a1.020.03b5%图1、不同的添加剂对凡纳滨对虾生长的影响（江苏如东）注:根源研发中心如东实验组提供 复合益生菌+酶制剂在

9、对虾养殖中应用长期使用酵后，可有效调控水体的氨氮含量，长期维持氨氮、亚硝酸盐较低水平。注:根源研发中心如东实验组提供 复合益生菌+酶制剂在对虾养殖中应用酵天天吃年年好 酶制剂在水产饲料中应用p 常规饲用酶制剂p 淬灭酶p 溶菌酶p 其它 酶制剂作用特点作用的高效性：酶催化反应速度比非催化反应高1081020倍；比化学催化剂的催化速度高1071013倍。专一性：一种酶只作用于某一种或某一类特定的底物。不稳定性：蛋白质，稳定性较差，受热或其它因素作用， 很容易发生变性而失去活性。底物特异性：一种酶通常只能作用于一种类型的化合物或化学键酵天天吃年年好 酶制剂种类构成n 消化酶动物自身可以分泌的、具有

10、消化作用的酶，它包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶。n 非消化酶动物自身不能分泌的酶，能消化动物自身不能消化的物质或降解一些抗营养因子非淀粉多糖酶木聚糖酶 、甘露聚糖酶、-葡聚糖酶等植酸酶提高磷的利用率 酶制剂的功能弥补内源性消化酶作用的不足调节肠道菌群结构消除植酸、非淀粉多糖等的抗营养作用环保功能减少磷、有机物等排放扩大饲料原料的选择范围破坏植物细胞壁，释放细胞内的营养成分 水产酶制剂的特殊性低温不用动物生理结构差异水中稳定性变温动物， 水温低，不稳定 不同动物食性不同胃pH差异大 水中投喂稳定性高 加工工艺复杂排空时间短作用时间短需要蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶 非淀粉多糖酶及植酸酶 膨化料温度压力高虾

11、料熟化时间长 内源酶分泌差别大 制粒加工温度高 消化道短 水产复合酶对虾应用试验 植酸酶和非淀粉多糖酶对鲈鱼生长和消化酶的影响张璐等，2009，水生生物学报 植酸酶和非淀粉多糖酶对鲈鱼生长和消化酶的影响张璐等，2009，水生生物学报 淬灭酶细菌的 QS 系统革兰氏革兰氏阳性细菌的 QS 系统 兼具上述两种群体感应特点的复杂 QS 系统 Acyl-homoserine lactone (AHL)-lactonase EC 1Paraoxonase (PONs) EC 3AHL-acylase EC 7Oxidoreductase EC 1.2?N-酰基

12、高丝氨酸内酯酶N-酰基高丝氨酸内酯（信号分子） 36Oxidoreductase 3-oxo substituents? AHL-degrading enzymes淬灭酶（续） 3.74 U/g饲料Cao et al., 2012, AEM37 AHL-degrading enzymes淬灭酶（续） NJ-1NJ-1+AIO6NJ-1+JCM 1149Tilapia foregut罗非鱼前肠 嗜水气单胞菌NJ-1 Liu et al., unpublished data38Summary: AIO6比JCM 1149表现优异 AHL-degrading enzymes淬灭酶（续） C: 饲喂基

13、础饲料+2.5 10 8 cfu/mL NJ-1浸浴攻毒，D: 饲喂含淬灭酶基础料+ 2.510 8 cfu/mL NJ-1浸浴攻毒，E: 饲喂基础饲料+0.710 8 cfu/mL NJ-1浸浴攻毒，F: 饲喂含淬灭酶基础料+ 0.7 10 8 cfu/mL NJ-1浸浴攻毒 AIO6降低了病原细菌肠壁黏附能力.39He et al., 2012, Journal of Fisheries of China AHL-degrading enzymes淬灭酶（续） 淬灭酶控制了病原菌但完全改变了肠道黏附菌群结构！ 下一步：淬灭酶+特定益生菌？ 40Cao et al., 2014, JWAS

14、溶菌酶p 溶菌酶：一类具有免疫保护作用的天然抗菌肽,广泛存 在于各种动物、植物、微生物中；无毒、无害、专一性强， 已经广泛应用于医疗、食品等行业。 溶微菌生酶物源溶菌酶 溶菌酶作用消化酶非特异性免疫作为非特异性生物防御因子能对某些细菌发挥先天抵抗作用,可诱导 其他免疫因子的合成和 分泌。 消化细菌方面的作用-软体动物 免疫消化溶菌酶作用 热变性水解细胞壁热变性后的溶菌酶仍然具有抑菌作用，即溶菌酶能够通过非酶途径杀灭革兰氏阳性和菌 水解肽聚糖的B-1,4-糖苷键而导致细菌的裂解 水解几丁质的N-乙酰氨基葡萄糖 键,从而杀灭真菌和原生动物 糖苷键稳定 其它酶制剂p

15、GOD（葡萄糖氧化酶）进行酶促反应，消耗肠道的氧气或氧自由基，产生了葡萄糖酸及过氧化氢，促使形成肠道酸性和无氧环境，为有益菌的增殖制造条件，直接抑制有害菌的生长繁殖。p SOD消除了动物应激产生的过氧化物，保护肠道粘膜。 存在问题与发展方向 益生菌的风险饲喂过程中发生基因转移乳酸菌具有多种抗生素抗性基因 停喂乳酸菌后造成肠道微生态失衡 鱼类肠道微生物存在不可思议的个体差异炎症诱导（免疫刺激）、肠道应激-肠道黏附菌群结构稳态 基因转移个体差异停喂应激肠道菌群结构 菌酶添加剂水产应用现状颗粒型其他型液态： 生产简单、拌料复杂、溶失多半湿态：固体发酵简单、溶失浪费多硬颗粒：70-90 0.1-0.4Mpa ，菌酶存活