分子印迹整体柱的制备及在线固相萃取液相色谱测定食品中兽药残留

1、分子印迹整体柱的制备及在线固相萃取液相色谱测定食品中兽药残留 密 级: 学校代码:10075 分类号: 学 号:20101083 理 学 硕 士 学 位 论 文分子印迹 整体柱 的制 备及在线 固相萃 取-液相色谱 测定食 品中 兽药残留 学 位 申请人:杨 磊 指 导 教 师:吕运开 教授 学 位 类 别:理学硕士 学 科 专 业:分析化学 授 予 单 位:河北大学 答 辩 日 期:二一三年六月 Classified Index: CODE: 10075 U.D.C.: NO: 20101083A Dissertation for the Degree of M.ScPreparation

2、and Evaluation of Molecularly Imprinted Monolithic Column for Determination of Trace Veterinary Drugs Residues in Food by On-Line SPE -HPLC Candidate: Yang Lei Supervisor: Prof. Lv Yunkai Academic Degree Applied for: Masters Degree Specialty: Analytical Chemistry University: Hebei University Date of

3、 Oral Examination: June,2013摘 要 摘 要 将分子印迹技术,结合整体柱高通量、低柱压且简单实用的特点,合成了一种作为预富集柱使用的分子印迹有机整体柱,并在此基础上,结合溶胶-凝胶技术,引入无机组份杂化复合,改进了分子印迹有机整体柱易溶胀、使用寿命短等缺陷。将分子印迹整体柱作为预富集柱与高效液相色谱联用,从而发展了一种在线固相萃取-液相色谱测定复杂基质中痕量药物残留的简单高效新方法。全文共分四个部分,主要工作如下: 第一章:评述兽药残留的危害及其检测方法,分子印迹固相萃取及在线固相萃取兽药残留检测的应用,整体柱及杂化整体柱的研究进展。 第二章:以恩诺沙星为模板,甲基丙

4、烯酸和甲基丙烯酸羟乙酯为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂,甲苯、十二醇为溶剂,聚乙二醇为分散剂,在不锈钢色谱柱中合成了恩诺沙星印迹整体柱,优化合成条件,并通过整体材料外观,扫描电镜图及动态穿透实验对其性能进行了表征,作为预柱应用于在线固相萃取过程,对牛奶样品中的基质净化效果很好。 第三章:制备四环素印迹有机整体柱,并应用于在线固相萃取-液相色谱法测定奶粉中四环素类残留,优化了合成条件,通过扫描电镜图和动态穿透实验对其特异性和选择性进行了表征,并系统研究了在线固相萃取步骤,优化了淋洗溶剂的选择和用量,得到了很好的净化和富集效果。 第四章:以恩诺沙星为模板分子,甲

5、基丙烯酸和甲基丙烯酸羟乙酯为功能单体,四乙氧基硅烷和甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷为无机前驱体,甲苯和聚乙二醇-200为致孔剂,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,在不锈钢色谱柱中,制备了一种新的分子印迹有机-无机杂化复合整体柱。采用红外、扫描电镜、热重分析、动态吸附实验和溶胀实验分别表征了整体柱的化学基团变化、形貌、热稳定性、动态吸附特征和溶胀性。将制备的整体柱用作预富集柱,实现了样品离心后直接进样的在线固相萃取-高效液相色谱法分离和测定牛奶中痕量氟喹诺酮类药物残留,获得了较好的净化和富集效果(18.5),-1平均回收率为 89.1-99.2%,精密度为 3.55-4.32%,方法检出限小于 3.7

6、4 ?g kg 。关键词分子印迹整体柱 杂化复合材料 在线固相萃取 兽药残留 奶制品 I Abstract Abstract A new molecularly imprinted monolithic column was successful prepared by combining molecular imprinting technique with the monolithic column synthesis technology for a simple pre-concentration column based on its high throughput and low

7、backpressure. A novel molecular imprinted organic?inorganic hybrid composite monolithic column MIP-HCMC was prepared in a stainless-steel chromatographic column using sol-gel technique. The monolithic columns were used as precolumn for determination of trace antibiotics residues in complex matrix by

8、 on-line solid-phase extraction - HPLC. This thesis consists of four chapters and as follows: Chapter 1: The dangers of antibiotics residues and its detection methods were introduced. The application and progress of the molecular imprinted monolithic column and solid-phase extraction SPE in antibiot

9、ics residues were reviewedChapter 2: A molecularly imprinted monolithic column MIMC was prepared using enrofloxacin ENR as the template molecule, methylacrylic acid and 2-hydroxyethyl methacrylate as functional monomer and trimethylol propane trimethylacrylate and ethylene glycol dimethacrylate as t

10、he crosslinking monomer, toluene, dodecanol and polyethylene glycol as porogenic solvent in traditional stainless-steel chromatographic column. Scanning electron microscope SEM images and overall appearance, together with the dynamic adsorption capacity of the MIMC were employed to optimize the prep

11、aration conditionsAccordingly, the MIMC was used as on-line solid-phase extraction column for selectively purifying the matrix in milkChapter 3: The tetracycline molecularly imprinted monolithic column was prepared for on-line SPE-HPLC detecting of trace TCs residue in milk. The synthesis conditions

12、 were optimized. The morphology and dynamic adsorption characteristic of the monolithic column were characterized by SEM and dynamic binding test, respectively. The on-line SPE procedure was carefully investigated and a good clear-up and preconcentration effect was obtained under the optimized washi

13、ng conditionII Abstract Chapter 4: A novel molecular imprinted organic?inorganic hybrid composite monolithic column MIP-HCMC was prepared in a stainless-steel chromatographic column for the determination of fluoroquinolones residues in milk by on-line solid-phase extraction coupling with HPLC. The M

14、IP-HCMC was prepared using enrofloxacin as the template, methacrylic acid and 2-hydroxyethyl methacrylate as functional monomers, tetraethoxysilane as inorganic precursor and methacryloxypropyltrimethoxysilane as coupling agent, toluene and polyethylene glycol as porogenic solvent, ethylene glycol d

15、imethacrylate as cross-linking agent. Synthesis conditions were optimized. The chemical group, morphology, thermal stability, dynamic adsorption characteristic and swelling of the monolithic column were characterized by IR, SEM, TG, dynamic binding test and swelling test, respectively. An enrichment

16、 factor EF of 18.5 along with a good sample clean-up effect was obtained under the optimized conditions when it was applied to the milk sample analysis only after centrifugation. The average recoveries of four fluoroquinolones spiked milk at 0.05, 0.1 and -10.25 mg kg were in the range of 89.1-99.2%

17、 with the precision of 3.55-4.32%. The limits of -1detection and quantitation of the proposed method were 1.69 and 5.63 ?g kg for ofloxacin, -1 -11.63 and 5.43 ?g kg for lomefloxacin, 3.74 and 12.5 ?g kg for ciprofloxacin, 1.37 and 4.56 -1?g kg for enrofloxacin, respectively. The proposed method was

18、 successfully applied to on-line extraction and determination of fluoroquinolones antibiotics in milkKeywords Molecularly imprinted monolithic column Hybrid composite materialsOn-line solid-phase extraction Veterinary drugs residue MilkIII 目 录 目 录 第1章 绪 论? 1 1.1 兽用抗生素的概述? 1 1.1.1 定义、结构与理化性质 ? 1 1.1.

19、2 兽用抗生素残留与危害 ? 3 1.1.3 动物源性食品中抗生素残留检测研究进展? 3 1.2 分子印迹固相萃取技术在兽药残留检测方面的应用? 4 1.2.1 固相萃取技术简介 ? 4 1.2.2 分子印迹技术简介 ? 5 1.2.3 分子印迹在线固相萃取技术 ? 6 1.3 分子印迹整体柱研究进展 ? 7 1.3.1 整体柱简介? 7 1.3.2 分子印迹整体柱的制备及应用 ? 7 1.4 主要研究内容及创新点 ? 10 第2章 分子印迹有机整体柱的制备、表征及吸附特性研究? 11 2.1 前言? 11 2.2 实验部分? 12 2.2.1 试剂和仪器? 12 2.2.2 分子印迹有机整体

20、柱的制备 ? 12 2.2.3 动态穿透实验? 13 2.2.4 色谱条件? 13 2.2.5 在线固相萃取? 14 2.2.6 实际样品处理? 14 2.3 结果与讨论? 15 2.3.1 合成条件优化? 15 2.3.2 选择性吸附考察? 17 2.3.3 特异性吸附考察? 18 IV 目 录 2.3.4 在线固相萃取条件优化 ? 18 2.3.5 标准曲线及工作曲线 ? 19 2.3.6 富集与净化? 19 2.3.7 奶样中氟喹诺酮类抗生素残留的测定 ? 21 2.4 本章小结? 22 第3章 分子印迹有机整体柱在线固相萃取-液相色谱测定奶粉中四环素类残留? 23 3.1 前言? 23

21、 3.2 实验部分? 24 3.2.1 试剂和仪器? 24 3.2.2 色谱条件? 24 3.2.3 分子印迹有机整体柱合成 ? 24 3.2.4 动态穿透实验? 25 3.2.5 在线固相萃取实验 ? 26 3.2.6 实际样品分析? 26 3.3 结果与讨论? 27 3.3.1 分子印迹有机整体柱合成条件优化 ? 27 3.3.2 选择性吸附考察? 28 3.3.3 特异性吸附考察? 29 3.3.4 在线固相萃取条件优化 ? 29 3.3.5 标准曲线及工作曲线 ? 29 3.3.6 富集与净化? 30 3.3.7 奶粉样品中四环素类抗生素残留的测定? 31 3.4 本章小结? 32 第

22、 4 章 分子印迹杂化复合整体柱的制备及在线固相萃取-液相色谱测定牛奶中氟喹诺酮类残留? 33 4.1 前言? 33 4.2 实验部分? 34 4.2.1 试剂与仪器? 34 V 目 录 4.2.2分子印迹杂化复合整体柱合成 ? 34 4.2.3 色谱分析条件? 34 4.2.4 动态穿透实验? 35 4.2.5 亲水性测试? 35 4.2.6 实际样品分析? 36 4.3 结果讨论? 37 4.3.1 分子印迹杂化复合整体柱合成条件优化? 37 4.3.2 红外光谱表征? 39 4.3.3 热重分析? 40 4.3.4 溶胀性考察? 40 4.3.5 扫描电镜图? 41 4.3.6 耐压性测

23、试? 41 4.3.7 亲水性测试? 42 4.3.8 特异性及选择性吸附考察 ? 42 4.3.9 标准溶液的富集效果 ? 43 4.3.10 在线联用技术在实际样品分离分析中的应用 ? 44 4.4 本章小结? 45 参考文献 ? 47 致 谢 ? 58 攻读学位期间取得的科研成果 ? 59VI 第 1 章 绪 论 第 1章 绪 论 食品安全问题事关国民经济发展的大局,是影响国民经济能否稳定协调发展的重要因素之一,既危及消费者的健康,会造成重大的经济损失,也会发生国际层面上的食品贸易的争端,最后还往往会导致政治后果。近几年来,我国食品安全事件频繁发生,如三鹿奶粉事件、阜阳大头娃娃劣质奶粉事

24、件、苏丹红事件、含孔雀石绿水产品、猪肉瘦肉精事件,以及农兽药残留超标等。特别是奶制品安全问题不断发生,为此,国家和地方都制定了系列检测标准,这些标准有个共性缺点:仪器昂贵、操作复杂、检测成本高,不适合在基层检测部门广泛推广和企业使用。因此,有效的分离检测技术已成为食品安全有效监管的关键环节,急需发展适合我国国情的简便、低成本、高灵敏度分离检测方法。 1.1 兽用抗生素的概述 1.1.1 定义、结构与理化性质 四环素类抗生素tetracycline antibiotics,TCs是放线菌产生的一类广谱型抗生素,包括四环素tetracycline、土霉素oxytetracycline、金霉素chl

25、otetracycline、去甲基金霉素Demeclocycline及其半合成衍生物强力霉素Doxycycline、美他环素Metacycline、二甲胺基四环素等,结构上均含并四苯基本骨架见图 1-1。OH 四环素 Tetracycline TC 土霉素 Oxytetracycline OTCCl OHCl OH金霉素 Chlortetracycline CTC 去甲基金霉 素 Demeclocycline DMC 1 河北大学理学硕士学位论文强力霉素 DoxycyclineDOTC 美他环素 Metacycline MTC 图 1-1 四环素类抗生素的化学结构 Fig.1-1 Chemic

26、al structures of tetracycline antibiotics 相近的物质结构决定了四环素类抗生素相似的理化性质,黄色结晶粉末,味苦。在酸性、碱性条件下均不稳定,且见光易分解。因其含有苯环、酮基和烯醇等所组成的共轭体系,有了两个发色团,故在 260 nm左右和 350 nm左右均有较强的紫外吸收。四环素类抗生素是广谱型抑菌药物,除革兰氏阳性、阴性细菌之外,对立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体均有明显的抑制作用。 氟喹酮类 Fluoroquinolones抗生素是一类化学合成抑菌剂,淡黄色或微黄色结晶粉o末,易溶于氢氧化钠溶液、甲醇等有机溶剂,不易溶于水。无嗅、无旋光性,熔点

27、为 215 C左右。氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星结构式如图 1-2: OOFFCOOH COOHN N N NN O HN 氧氟沙星 OfloxacinOFL 环丙沙星 CiprofloxacinCIP O OOFF COOHOHN NN NHN FN 恩诺沙星 EnrofloxacinENR 洛美沙星 LomefloxacinLOM 图 1-2 OFL、CIP、ENR、LOM的分子结构式 Fig.1-2 Chemical structures of fluoroquinolone antibiotics此类药物可以抑制细菌体内的 DNA螺旋酶,从而呈现较强抗菌活性,且抗菌谱广、2

28、第 1 章 绪 论 耐药性不与其他抗菌药物交叉、毒副作用小,故而被广泛用于兽医学和人类医学,如动1物和人类的感染性疾病的治疗等 。 1.1.2 兽用抗生素残留与危害 因其具有广谱抗菌性,此两种抗生素被广泛应用于预防和治疗多种禽畜疾病,还可2-5以促进禽畜生长,防治动植物病害和用于食物保鲜等 。但在动物饲料中长期过量的添加抗生素,不遵守休药期有关规定;不正确使用兽药和滥用兽药,使用未经批准的药物;饲料加工过程受到兽药污染或运送出现错误;按错误的用药方法用药,或未做用药记录;屠率前使用兽药,都势必导致这些动物源性食品里抗生素残留超标。人类长期食用这些抗生素超标的食物,会导致其在体内的累积,当药物累

29、积到一定量时,就会在人体内产生耐药菌株,造成肝损害、肾损害等,还会影响骨骼及牙齿的发育,产生过敏反4,5应,使肠道菌群失调等。这都将严重威胁人类的安全与健康,值得高度关注 。 加强对各类抗生素使用的控制刻不容缓,很多国家和地区均已制定了相关规定,来限制抗生素在动物源性食品中的最大残留限量imum residue limits,MRLs,即食品中药物残留的最高量。而对于抗生素 MRLs 的规定,各国规定不尽相同。对于 FQs,我-1 6 -1 国和欧盟规定其在动物源性食品中 MRLs为 0.01-1.9 mg kg ,日本为 0.01-0.05 mg kg7;对于 TCs,美国食品及药物管理局F

30、DA规定其在动物源性食品中的 MRLs 在牛奶-1 -1 -1中为 4 mg kg ,在肝脏中为 6 mg kg ,在肉中为 2 mg kg ,欧盟规定的 MRLs肝脏中-1 -1为 0.3 mg kg ,肉类和奶类中为 0.1 mg kg ,英国和比利时规定的 MRLs均为 0.05 mg -18-10 -1kg 。我国农业部公告,第 235号中规定 MRLs奶类和肉类中为 0.1 mg kg ,在肝-1脏中为 0.3 mg kg 。 1.1.3 动物源性食品中抗生素残留检测研究进展 自上世纪末起,农业部及国家质检总局出台了一系列动物源性食品中氟喹诺酮类及四环素类抗生素残留检测的标准,通过高

31、效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、高效毛细管电泳法、酶联免疫法、化学发光法等方法测定奶类、蜂蜜、动物肌肉组织以及水产品等中的氟喹诺酮类及四环素类抗生素残留,为动物源性食品中兽用抗生素残留的测11-16定提供了有力的依据 。 各类方法相比较而言,酶联免疫法和化学发光法简单高效,但测定结果准确性和精密度较低,且检出限较高,难以起到实际作用;液相色谱-质谱联用法适用范围广,分3 河北大学理学硕士学位论文 析灵敏度较高,能够同时进行组分检测,但对仪器要求高,检测价格昂贵,难以广泛推17, 18广使用;高效液相色谱法和高效毛细管电泳法,以紫外-可见检测器 、二极管阵列19, 20 21-23检测器 、

32、荧光检测器 为数据采集处理手段,具有准确、快速、高效、高灵敏度的特点,因而被广泛使用。 1.2 分子印迹固相萃取技术在兽药残留检测方面的应用 随着高效液相色谱法被广泛用于抗生素残留的检测,而样品前处理方法已成为食品安全分析技术中的关键,也是限制高灵敏度仪器的瓶颈。常用的样品前处理技术以下几种:液液萃取、索式提取、超声萃取、微波萃取、加速溶剂萃取、超临界萃取、固相萃取、固相微萃取、基质分散萃取、膜萃取技术等。 基于食品样品基体和组成复杂,而被分析物浓度较低的状况,往往需净化、富集才能有效检出,传统的样品前处理技术液液萃取等,存在溶剂用量多、处理时间长、操作21, 23步骤繁琐、回收率低、所需样品

33、量大等缺点 。相比而言,固相萃取技术凭借简单准确、高效环保的优势,被广泛研究和应用。 1.2.1 固相萃取技术简介 23-26固相萃取技术Solid-Phase Extraction,SPE 是一种液相色谱分离,利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物与干扰化合物分离,达到分离和富集目标化合物的目的。采用高效、高选择性的固定相进行萃取的样品预处理技术。最早始于 20世纪 70年代,并逐渐在药物、毒物分离分析中得以应用。其基本原理,是以固相吸附介质吸附样品中的待分析物,并以适当的溶剂淋洗除去杂质,再用适当的溶剂将待分析物洗脱下来,达到分离纯化的目的,进而进行检测。SPE 所要达到的目的是:1 从试

34、样中除去对以后的分析有干扰物质;2 富集痕量组分,提高分析灵敏度;3 变换试样溶剂,使之与分析方法相匹配;4 原位衍生;5 试样脱盐。目前生物体组织液、环境污染物、农兽药残留、食品中化学成分等复杂样品中痕量目标物的分离分析,普遍采用了 SPE19, 20, 22技术作为其样品前处理的方法 。 固相萃取技术作为一种样品的前处理方法,与传统液液萃取相比,不仅可以克乳化现象,减少了有机溶剂用量和萃取过程中样品丢失,而且操作简便,消耗低,选择性好,易于联用和自动化等,这些优点都有助于实现了样品中痕量分析物的分离分析,所以被27, 28广泛研究并应用 。 4 第 1 章 绪 论 固相萃取柱所使用的填料多

35、种多样,基本归结为如下几类: 1吸附型填料,如硅胶、硅藻土、硅酸镁、活性炭、氧化铝等;2化学键合相硅胶填料,如正相的氨基、腈基、二醇基等,反相的 C1、C2、C6、C8、C18 等,这种填料比表面积大,选择性好; 3离子交换填料,如氨基、二氨基、季胺、苯磺酸基、羧基等,其分离对象主要为离子型化29-31合物 。传统固相萃取柱填料中普遍存在特异性吸附能力差的缺陷,远远不能满足将痕量分析物从复杂基质中选择性提取出来的要求,因此新型的分子印迹聚合物受到人们极大地研究兴趣。 1.2.2 分子印迹技术简介 32分子印迹技术是仿照抗体的形成机理 ,在模板分子周围形成高度交联的刚性高分子聚合物,除去模板分子

36、后,在聚合物的网络结构中留下具有结合能力的反应基团的活性位点,从而能高度识别模板分子及其类似物的一种技术。如图1-3所示。 图 1-3 印迹过程示意图 33Fig.1-3 Schematic diagram of the imprinting process 34, 35 用分子印迹聚合物Molecularly Imprinted Polymers,MIPs 作为填料装填的固相萃取柱就是分子印迹固相萃取柱MISPE。自 1994年首次报道以戊脒为模板制备印迹聚合物并将该材料作为吸附剂,对尿样中戊脒进行了提取、纯化和浓缩开始,MISPE在生物及食品样品中有害物质如农药、兽药、食品添加剂和违禁用药

37、物的萃取分离应用已36 有很多的报道。其中, Lom-Bardo-Agui等 采用商品化 MISPE柱,结合毛细管电泳法,利用激光诱导荧光检测器,建立了简单、灵敏且选择性好的测定方法,用于分析牛奶和-1猪肾样品中 4种喹诺酮药物含量,回收率为 85.2-98.6%,检出限为 0.17-10.5g kg 。 37 Yang 等 以三聚氰胺为模板分子、MAA 和 EGDMA 作为单体和交联剂,在乙醇5 河北大学理学硕士学位论文 水体系10/3,v/v中,采用本体热聚合方式制备了水溶液中对三聚氰胺有较高选择性的印迹材料,并应用于液态奶、奶粉等奶制品中三聚氰胺残留检测。结果表明,水和甲醇淋洗、甲醇氢氧化铵溶液95/5,v/v洗脱可使三聚氰胺有效地被萃取净化、富集,回收率为 91.6-102.8%。 然而,我们在进一步研究中发现常用分子印迹聚合物在不同的溶剂作用下会产生不同程度的溶胀作用,从而造成分子印迹聚合物吸附空穴变形或者塌陷,影响特异性吸附能力,因此一种新型吸附剂有待开发。 1.2.3 分子印迹在线固相萃取技术 固相萃取技术可以分为离线固相萃取和在线固相萃取两种模式,分别于高效液相色谱联用。目前,大多数固相萃取仍采用离线萃取方法,其操作步骤分为柱活化、上样、淋洗、洗脱四个步骤。离线固相萃取法