饲料中色氨酸的测定 微波水解-氨基酸自动分析仪法编制说明

1、饲料中色氨酸的测定 微波水解-氨基酸自动分析仪法 编制说明一、 任务来源，起草单位，主要起草人本标准是根据“内蒙古质监局关于下达2018年第二批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知（内质监标函2018154号）”，由内蒙古自治区农牧业科学院组织有关科技人员，制定饲料中色氨酸的测定 微波水解-氨基酸自动分析仪法标准。起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院；主要起草人：宋洁、姚一萍、敖长金、王丽芳、史培、冯小慧、王雪娇、狄彩霞、景宇鹏、张欣昕、张三粉、羿静、钟华晨、郭晨阳。二、 制定本标准的必要性和意义我国是畜牧业生产大国，随着人口的不断增长，人类营养供给依赖畜牧业的比重进一步加大，对畜禽肉、蛋、

2、奶类等产品的要求也越来越高，从简单注重养殖量的增长向畜禽产品营养均衡发展转变。内蒙古畜牧业规模居全国五大牧区之首，具有丰富的饲料资源优势，做好内蒙古饲料营养品质评定工作，对于规范化营养优质饲料原料的生产和开发，保证和支持畜牧业的健康快速发展十分必要。蛋白质是饲料中的主要营养成分，在动物营养中起着极重要的作用。饲料中构成蛋白质的各种氨基酸种类及数量直接关系到动物的生长和肉质水平，因此氨基酸含量分析成为衡量饲料蛋白质营养品质的一项重要依据。色氨酸（Tryptophan）属于芳香族氨基酸，是动物新陈代谢所必需的八种氨基酸之一，对动物的生长和氮平衡非常重要，要正确全面的评价饲料蛋白质营养价值，必须测定

3、色氨酸。色氨酸作为一种功能性氨基酸，在动物体内不仅参与酶促反应及体蛋白合成，其代谢产物5-羟色胺、褪黑激素、烟酸等活性物质还参与了动物采食、生长、生殖、免疫、抗应激等多方面的调控作用，对动物的生长发育影响很大。在动物研究中发现，低蛋白饲料中补充富含色氨酸的饲料原料，可提高动物的摄食量、生长性能、促进营养物质消化吸收，能够获得与高蛋白饲料相似的生长效果。色氨酸还可参与动物体内血浆蛋白质的更新，促使核黄素发挥作用，有助于血红素的合成，并能显著增加妊娠期动物胚胎抗体水平，对泌乳期的母牛和母猪有促进泌乳的作用。色氨酸缺乏将导致动物出现生长停滞，体重下降，脂肪积累降低等一系列问题。由于动物自身不能合成色

4、氨酸，必须从饲料中摄取，因此饲料中色氨酸含量的准确测定，对于动物体内色氨酸的平衡及正常生长发育至关重要。由于色氨酸在酸性条件下易分解，因此在使用氨基酸自动分析仪进行时测定时，无法通过酸水解与其它氨基酸同步测出含量，必须单独测定。目前，色氨酸的测定主要通过常规碱水解，采用高效液相色谱或分光光度法测定。然而常规碱水解方法耗时过长，色氨酸会被轻微破坏，烘箱温度也不易控制。此外，液相色谱法存在出峰较慢、分析时间长、检测灵敏度不高等问题。分光光度法易受颜色深浅或杂质干扰，影响测定结果准确性。采用微波碱水解法水解样品，不但可以避免以上麻烦，而且易于控制碱水解条件，结合全自动氨基酸分析仪上机测定，两者均具有

5、安全、省时、操作简便等优点。因此本标准采用微波水解氨基酸自动分析仪法相结合的方式，适用于大规模饲料样品中色氨酸的高效、准确测定，对于规范化和标准化内蒙古饲料营养品质评定工作具有十分重要的意义。三、 主要起草过程(一) 标准制定过程根据农业部关于“国家农产品质量安全风险评估重大专项”项目实施要求，在标准制定过程中，主要起草人首先于2018年下半年查阅大量国内外相关文献资料并确定了实施方案，并于2019年根据项目实施方案要求，在内蒙古农牧业科学院资源环境与检测技术研究所实验室开展了大量试验分析工作，通过单因素试验和正交试验分析筛选出微波碱水解最佳处理条件，并经过与国标方法及同行单位比对验证了试验结

6、果的准确性。在此基础上，项目组起草了饲料中色氨酸的测定 微波水解-氨基酸自动分析仪法标准编制说明。主要参考文献如下：1 赵艳,宋军,张艳红,等.微波辅助蛋白质水解-反相高效液相色谱法测定饲料中的色氨酸J.中国饲料,2018, 611(15):72-75.2 陈彩云,黎小兰,张喜金, et al.微波水解-液相色谱串联质谱法测定16种氨基酸的含量J.食品安全质量检测学报,2018, 9(17):255-259.3 Jonathan D,Norman W.HPLC Determination of Total Tryptophan in Infant Formula and Adult/Pedia

7、tric Nutritional Formula Following Enzymatic Hydrolysis: Single-Laboratory Validation, First ActionJ. Journal of AOAC International,2017,03(4):4.4 陶玉,蔡慧侠,罗晶,等.微波水解法测定人工虎骨粉中总氨基酸含量J.中医药导报,2017(16):80-81.5 任晓宇,裴晓静,张少云,等.微波水解衍生高效液相色谱法测定饲料中的氨基酸J.分析测试学报,2017(10):97-101.6 李成成,尤晓蒙,付珺,等.高效液相色谱测定饲料中色氨酸含量方法的研究

8、J.食品工业科技,2016,37(9):308-310.7 李丰,叶竹林,郑卫红,等.鱼粉国标中氨基酸指标的快速检测方法J.饲料工业,2015,36(24):64-65.8 周虹,毛建霏,罗玲,等.微波碱水解法测定农产品中色氨酸含量J.食品与发酵科技,2014(3):79-81.9 周虹,罗玲,郭灵安,等.烟叶样品中18种氨基酸的微波水解分析方法研究J.西南农业学报,2014,27(6).10 Stam P,Boogers I,Plugge W, et al. Determination of Tryptophan in Lysozyme and Lysozyme Hydrolysate by

9、 Chiral LC Using d-Tryptophan as Internal StandardJ.Chromatographia,2009,69(11): 1-6.(二) 测定条件优化微波水解是在微波电磁场的作用下，微波通过试样及水解液时，极性分子随微波频率快速变换取向，分子来回转动，与周围分子相互碰撞摩擦，分子的总能量增加，使试样温度急剧上升，这种加热方式与传统的加热方式相比更有利于试样消化，在不影响检测准确度的前提下，大大缩短了水解时间，提高了工作效率，减小了劳动强度。目前，采用常规的酸水解法测定蛋白质氨基酸的含量，因为色氨酸在酸水解过程中几乎都被破坏，无法与其他的氨基酸一起测定，所

10、以只能单独的测定。色氨酸必须通过碱水解，才能从蛋白链中释放出来。因此，本标准采用微波碱水解法，利用微波水解仪研究微波碱水解的诸多影响因素，筛选出微波水解的最佳碱浓度、水解温度和水解时间。通过氨基酸自动分析仪测定饲料中色氨酸的含量，研究微波碱水解-氨基酸自动分析仪联合快速测定饲料中色氨酸的方法。同时进行线性关系考察、回收率试验及精确度试验等。1材料与方法1.1材料与试剂L-色氨酸（L-Trp，纯度99%）标准品，美国sigma-Aldrich公司；甲醇（色谱纯），北京迪马科技公司；氢氧化钠（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司；盐酸（优级纯），成都市科隆化学品有限公司；其他试剂均为优级纯。饲

11、料：选取豆粕和奶牛全混合日粮（TMR）作为饲料样品代表，均采自内蒙古当地饲料市场。1.2仪器与设备微波水解仪（美国CEM公司，型号 Mars240/50），氨基酸自动分析仪（德国Sykam公司，型号S433D），万分之一天平（瑞士Mettlr Toledo公司，型号：XS105），干燥箱（德国Binder公司，型号ED115）；超纯水仪（美国Millipore公司，型号Milli-QA10）；台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号：TGL-20M）1.3试验设计1.3.1单因素试验在微波消解功率1200 W、升温10min、NaOH为碱解剂条件下，选取水解温度140、150、1

12、60、170、180，水解时间10、20、30、40min，碱浓度3、4、5、6mol/L分别进行单因素试验，研究这3个因素对色氨酸含量测定结果的影响。1.3.2正交试验根据单因素试验结果，以水解温度、水解时间、及碱浓度为研究对象，采用L9(34)正交表，设计三因素三水平正交试验，开展9次试验，每次试验设置3个重复（见表1）。表1 微波水解条件筛选正交试验因素水平表水平因素A温度 ()B时间（min）C浓度mol/L）1150203216030431704051.3.3样品处理 对于脂肪含量小于4%的样品，准确称取50100mg（精确至0.0001g），置于聚四氟乙烯水解管中，加5mL氢氧化钠

13、溶液，充氮气1min，根据单因素和正交试验条件选择碱浓度、水解温度和水解时间进行微波水解。取出水解管，冷却至室温，转移至25mL容量瓶，用6mol/L盐酸中和，使pH至中性，并用水定容，10000r/min离心10min，用0.45m滤器过滤后上机测定。对于脂肪含量大于4%的样品，需要先经过脱脂处理再按上述步骤进行色氨酸含量测定。2结果2.1色氨酸测定单因素试验结果2.1.1水解温度对色氨酸测定的影响采用5mol/L氢氧化钠溶液作为水解液，水解时间30min，分别考察140、150、160、170、180水解温度对色氨酸含量的影响。结果表明，随测定温度从140升高至180，色氨酸含量逐渐增加（

14、见图1），其中当水解温度160时，豆粕和TMR色氨酸含量均显著高于140时测定结果（P0.05）。虽然水解温度升至 180后豆粕和TMR色氨酸含量达到最高值，但由于温度过高容易导致碱液过沸损失以及水解管爆裂，因此选择170为色氨酸测定最佳水解温度。图1 水解温度对饲料色氨酸测定的影响2.1.2水解时间对色氨酸测定的影响如图2所示，在5mol/L氢氧化钠溶液作为水解液，提取温度170 条件下，水解时间在1030min时，色氨酸含量迅速升高，30min时豆粕和TMR色氨酸均显著高于其他各时间点（P0.05），40min时色氨酸含量逐渐降低，表明色氨酸可能部分被破坏。因此选择30min为最佳水解时间

15、。图2 水解时间对饲料色氨酸测定的影响2.1.3碱浓度对色氨酸测定的影响在水解温度170，水解时间30min条件下，分别选取3、4、5、6 mol/L的氢氧化钠作为水解液，不同碱浓度对色氨酸含量的影响见图3。碱浓度对豆粕和TMR色氨酸含量影响趋势相似，即随着碱浓度的增大，色氨酸的峰面积也随之增大，当碱浓度为5 mol/L时，色氨酸的含量达到最大值，继续增加碱浓度时，TMR色氨酸含量显著降低（P0.05），豆粕色氨酸含量呈下降趋势（P0.05）。由此确定水解液最佳浓度为5 mol/L。图3 氢氧化钠溶液浓度对饲料色氨酸测定的影响2.2色氨酸测定正交试验结果2.2.1色氨酸测定正交试验极差R值结果

16、正交试验极差R值结果见表2-3。影响豆粕色氨酸含量的各因素主次顺序为ABC，说明水解温度对豆粕色氨酸含量影响最大、水解时间其次、碱浓度影响相对较小，色氨酸含量测定最优组合为A3B2C3，即水解温度170、水解时间30min、碱浓度5mol/L效果最佳。影响TMR色氨酸含量的各因素主次顺序为ACB，色氨酸含量测定最优组合为A3B2C3，即水解温度170、水解时间30min、碱浓度5mol/L效果最佳，与豆粕结果一致。表2 豆粕色氨酸测定正交试验结果试验号因素TRP（%）A温度()B时间（min）C浓度（%）11(150)1(20)1(3)0.3340.037212(30)2(4)0.4670.0

17、15313(40)3(5)0.4300.01942(160)120.3830.05152230.5470.01662310.4720.01573(170)130.5770.00983210.5410.01493320.5270.011K11.2311.2941.347K21.4021.5551.377K31.6451.4291.554k10.4100.4310.449k20.4670.5180.459k30.5480.4760.518R0.4140.2610.207最优水平A3B2C3主次因素ABC最优组合A3B2C3表3 TMR色氨酸测定正交试验结果试验号因素TRP（%）A温度()B时间（h

18、）C浓度（%）11(150)1(20)1(3)0.0610.007212(30)2(4)0.1050.006313(40)3(5)0.1010.00742(160)120.1010.01252230.1370.00362310.1070.00973(170)130.1370.01183210.1240.00693320.1310.007K10.2670.2990.292K20.3450.3660.337K30.3920.3390.375k10.089 0.100 0.097 k20.115 0.122 0.112 k30.131 0.113 0.125 R0.1250.0670.083最优水平

19、A3B2C3主次因素ACB最优组合A3B2C32.2.2色氨酸测定正交试验方差分析结果正交试验方差分析结果见表4-5。水解温度、水解时间、碱浓度三个因素均对豆粕和TMR色氨酸含量的影响均达到极显著水平（P0.01）。通过对比偏差平方和和均方可知，A因素水解温度是影响饲料色氨酸含量测定最主要的因素，与2.2.1极差R值分析结果一致。表4 豆粕色氨酸测定正交试验方差分析方差来源偏差平方和自由度均方F值P值A0.08620.04335.1930.01B0.03420.01713.9640.01C0.02520.01310.2380.01误差0.025200.001表5 TMR色氨酸测定正交试验方差分

20、析方差来源偏差平方和自由度均方F值P值A0.00820.00456.2950.01B0.00220.00116.1870.01C0.00320.00224.3260.01误差0.001200.0002.3色谱条件氨基酸分析仪最佳工作条件见表6。色谱柱：水解氨基酸分析柱LCAK06/Na（4.6150 mm）；检测器：570 nm波长检测器；流动相：柠檬酸钠A:0.12 mol/L PH=3.45，柠檬酸钠B=0.2 mol/L PH=10.85，D为20 g/L NaOH溶液。流动相流速：0.45 mL/min；茚三酮流速：0.25 mL/min；柱温：74 ；反应器温度：130 ；进样体积：

21、50 L。色氨酸含量测定氨基酸分析仪洗脱梯度见表7，色氨酸标样及样品色谱图见图4。表 6 氨基酸自动分析仪最佳工作条件仪器条件仪器参数色谱柱LCA K06/Na（4.6150 mm）流动相柠檬酸钠A:0.12 mol/L,pH=3.45;B=0.2 mol/L,pH=10.85检测波长（nm）570流动相流速（mL/min）0.45茚三酮流速（mL/min）0.25反应器温度（）130柱温（）74进样体积（L）50表7 氨基酸自动分析仪洗脱梯度时间（min）A（%）B（%）C（%）D（%）流速（mL/min）1初始30.0 70.0 0.0 0.0 0.45215.0 30.0 70.0 0.

22、0 0.0 0.45315.1 0.0 0.0 0.0 100.0 0.45418.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.45518.1 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45630.1 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45730.2 30.0 70.0 0.0 0.0 0.00图4 标准品及饲料样品色氨酸色谱图2.4线性关系及定量限采用色氨酸标准储备液（c=1.00 umol/mL）进行校准曲线绘制，选取色氨酸含量分别为0.025、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60umol/mL的8个浓度点，以色氨酸含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y

23、）作出工作曲线（见图5）。色氨酸的线性方程为Y=373895.67791X，相关系数r=0.99989，完全符合实验室要求。结果表明：色氨酸在0.0250.60umol/mL浓度范围内峰面积与浓度线性关系良好。以10倍噪音水平对应浓度确定定量限，本方法定量限为0.05%。图5 饲料色氨酸含量线性关系图2.5精密度分别对豆粕和TMR饲料进行样品前处理后，在相同条件下平行进样6次，精密度实验平均值分别为0.52%和0.14%，RSD分别为，3.65%，3.58%。结果见表8。表8 饲料色氨酸含量精密度测定结果样品测定值（%）平均值（%）RSD（%）123456豆粕0.52 0.51 0.49 0.

24、52 0.54 0.52 0.52 3.65 TMR0.14 0.14 0.14 0.13 0.14 0.13 0.14 3.58 2.6回收率加标回收率结果见表9，豆粕色氨酸回收率为94-102，平均值为98%；TMR色氨酸回收率93-107%，平均值为99%。表9 饲料色氨酸回收率测定结果加标次序豆粕TMR加标浓度（%）检测浓度（%）回收率（%）加标浓度（%）检测浓度（%）回收率（%）10.510.521020.140.1510720.510.511000.140.1410030.510.50980.140.1410040.510.49960.140.139350.510.48940.14

25、0.1393平均值0.510.50980.140.14992.7稳定性试验将豆粕和TMR饲料样品色氨酸提取液在室温下放置1、2、3、4、5d后，在相同色谱条件下测定色氨酸含量（见表10）。本方法测定豆粕和TMR饲料样品色氨酸日间稳定性实验RSD值分别为1.07%、1.81%，稳定性良好。表10饲料色氨酸日间稳定性样品天数（d）平均值RSD（%）12345豆粕0.53 0.52 0.52 0.52 0.51 0.52 1.07 TMR0.14 0.14 0.14 0.14 0.13 0.14 1.81 2.8实验室比对结果本标准通过与3家区级重点实验室进行比对，统计比对结果可知，豆粕色氨酸含量平

26、均值为0.52%，RSD为2.43%；TMR色氨酸含量平均值为0.14%，RSD为2.95%（见表11）。表11饲料色氨酸含量实验室比对结果实验室名称豆粕TMR色氨酸含量（%）平均值（%）参考值（%）色氨酸含量（%）平均值（%）参考值（%）中国农业科学院草原研究所0.50 0.510.50 0.530.14 0.140.14 0.14内蒙古自治区饲料草种监督检验站 0.530.520.520.530.14 0.130.14 0.14内蒙古自治区农牧业科学院动物营养研究所0.510.510.510.530.130.130.130.143小结3.1本标准建立了微波碱水解测定饲料中色氨酸含量的方法，

27、根据单因素和正交试验结果，最佳微波水解条件是：水解温度170、水解时间30min、碱浓度5mol/L，其中水解温度是影响饲料色氨酸含量的最主要因素。3.2本标准采用氨基酸自动分析仪钠离子流动相系统分析色氨酸，线性关系和稳定性良好，方法回收率在93-107%之间。所测样品精密度RSD0.05），并具有相近的回收率。由于常规水解法耗时长，试剂成本高，而微波水解恰好克服了这一缺陷。这是源于微波辐射的“內加热”作用，加快了水解速度，提高了效率和灵敏度。表12 微波水解法与国标常规水解法豆粕色氨酸含量对比序号微波水解法常规水解法加标浓度（%）检测浓度（%）回收率（%）加标浓度（%）检测浓度（%）回收率（%）10.510.4894 0.510.4894 20.510.4996 0.510.50 98 30.510.52102 0.510.51100 平均值%0.51 0.50 97 0.51 0.50 97 表13 微波水解法与国标常规水解法TMR色氨酸含量对比序号微波水解法常规水解法加标浓度（%）检测浓度（%）回收率（%）加标浓度（%）检测浓度（%）回收率（%）10.140.14100 0.140.1393 20.140.14100 0.140.14 100 30.140.1393 0.140.1393 平均值%0.14