葡萄酒苹果酸乳酸发酵研究及其进展

1、葡萄酒苹果酸乳酸发酵研究及其进展 葡萄酒苹果酸乳酸发酵研究及其进展 摘要：苹果酸乳酸发酵(malolacticfermentation，mlf)在乳酸茵作用下将l一苹果酸脱羧基形成l一乳酸的过程。是葡萄酒生产难以控制的二次发酵过程，主要由酒类酒球菌引起。mlf对大部分红葡萄酒、一些白葡萄酒和汽酒最终的质量有重要的影响。自发进行的mlf结果往往难以预测，甚至引起葡萄酒的腐败。本文谨简要阐述引起mlf的微生物、mlf对葡萄酒品质的影响、mlf的生物学、影响mlf的因素、mlf在葡萄酒酿造中的应用等方面的研究现状，以期探索更好的控制mlf的技术。 关键词：苹果酸乳酸发酵 乳酸菌 影响因素 前言 葡萄

2、酒生产包括两个发酵过程，一个是由酵母引起的酒精发酵，另一个是由乳酸菌(1acticacidbacteria,lab)引起的苹果酸乳酸发酵(malolactiefermentation，mlf)。mlf可降低葡萄酒的ph值，产生香气物质使葡萄酒的感官性状发生改变，并保持葡萄酒的微生物稳定性。以往，葡萄酒的mlf完全依赖葡萄或葡萄汁中存在的lab引起，随着对引起mlf发生机理的认识和相应发酵剂的研究成功，mlf正越来越多的应用到葡萄酒酿造实践中，对酿造高档葡萄酒起到了巨大的推动作用。 1.引起mlf的微生物lab lab在自然界广泛存在，可存在于葡萄的果实和叶梗的表面。lab为原核微生物，为革兰氏

3、染色阳性菌，其生长繁殖需要从生物氧化中获得能量，当某化合物氧化时便失去电子，为平衡代谢某化合物接受电子而被还原。在苹果酸乳酸转化中，苹果酸是电子供体，而乳酸是电子的受体。lab也能用丙酮酸作为电子受体，并产生乳酸。 1.1 lab对糖的发酵类型 根据lab分解碳水化合物产物的不同，可以将其分为三类： (1)专性同型发酵：分解糖仅产生乳酸，不能利用戊糖生长。 (2)专性异型发酵：分解糖除产生乳酸外，还产生乙酸、乙醇和co2。 (3)兼性异型发酵：根据碳源不同，即可进行同型发酵，亦可进行异型发酵。 在同型发酵，培养基中大部分的糖转变为乳酸，乳酸是从丙酮酸的还原中产生的，一分子六碳糖分解产生两个分子

4、的乳酸。专性同型发酵利用糖酵解途径进行六碳糖的分解，但不利用戊糖磷酸途径，所以分解己糖产生两分子的乳酸。但这些微生物不分解戊糖。在异型发酵，lab利用戊糖磷酸途径进行糖的代谢，而不是糖酵解途径。通过这个途径，可以代谢五碳 糖或戊糖，在这种情况下，产生乳酸和醋酸。其它终产物的产生取决于环境和营养因子。专性异型发酵缺乏1，6一二磷酸果糖醛缩酶，这是糖酵解过程的关键酶，因此只能利用戊糖磷酸途径产生乳酸、醋酸、乙醇和co2。在异型发酵lab，也可从六碳己糖的分解产生醋酸，六碳己糖脱羧基后形成五碳糖，然后继续分解。如果条件不允许形成醋酸，便产生乙醇，如果氧气出现，细菌转移电子到分子氧形成水，有时形成过氧

5、化氢，如果有氧气存在这个过程就会占优势，因为这有助于多产生atp。兼性异型发酵可以利用两种途径，对分解己糖糖酵解是优先途径，但戊糖经戊糖磷酸途径发酵。然而在通风条件下，倾向于形成醋酸并产生能量。 1.2 参与mlf的lab的种类 研究表明，只有耐受低ph值(mlf对葡萄酒品质的影响很多，但主要表现在降酸、提高细菌稳定性和风味的改变。 2.1 降酸作用 mlf将氢离子固定在乳酸上可以使滴定酸度下降0.01g到0.03g酒石酸酸度l，ph增加0.3,这一点非常重要，因为如果葡萄酒ph低于3.5，lab的代谢活性可以升高ph水平,从而使葡萄酒的酸度降低，改善葡萄酒的口感。 2.2 提高细菌稳定性 m

6、lf可以提高葡萄酒中细菌的稳定性，mlf发生时由于营养物质的消耗或细菌素的产生其他微生物的生长受到抑制。mlf发生的时间也很重要，如果发生在葡萄酒装瓶之前，就可预防其在瓶中的生长。lab在瓶中的生长或可引起葡萄酒浑浊、co2产生，产生多糖导致酒体变黏，或ph提高促使其他腐败微生物的生长等。 2.3 风味的改善 葡萄酒经lab发酵之后，不仅产生乳酸，也产生其他代谢产物，对葡萄酒的风味产生影响。在有限通风条件下，酒类酒球菌倾向于产生乳酸和乙醇，欲产生更多乳酸则要求更多的通风。然而，其他lab在此条件下可能产生醋酸，醋酸本身有刺激性，所产生的醋酸的量非常重要，应避免超出感官检测的阈值。lab产生的另

7、一个重要的化合物是双乙酰，双乙酰有特征性的奶油风味。双乙酰的形成取决于前体物质的出现，可由乙醛和乙酰coa反应形成，或丙酮酸和乙醛反应产生五碳的乙酰乳酸，后者进而再形成四碳的双乙酰分子和一分子co2。lab发酵过程中可产生的2，3一丁二醇来自乙偶茵，具有淡淡的苦啤酒的风味，通常在检测阈值以下。它的形成是一个还原的过程，即电子以乙偶茵2，3一丁二醇的形式固定。lab发酵过程中还产生乳酸乙酯、丙烯醛等,对葡萄酒的风味产生影响。在含氮丰富的果汁发酵时，葡萄酒中出现奶酪的风味。赖氨酸是酵母的重要营养，但过量添加会导致出现所谓的鼠臭味。一些植物乳杆菌和短乳杆菌代谢酒石酸为醋酸，产生所谓的败坏病。这些是葡

8、萄酒酿造中不希望看到的。 3.mlf的生物学原理 mlf发生在lab生长的稳定期，其反应要求有nad+和mn2+，由苹果酸乳酸酶催化反应。这是一个直接的脱羧基反应，并不通过丙酮酸。苹果酸乳酸酶由苹果酸诱导产生。mlf发生时质子被固定乳酸上，形成所谓的跨膜“质子动力势”，即在细胞膜外质子的浓度高于细胞膜内，lab可以捕获这些能量并形成atp，但并不意味着每形成一分子乳酸便产生一分子atp，还取决于细胞膜上的atp酶的作用。苹果酸乳酸酶是参与mlf的惟一的酶，已从许多lab中分离除了这种酶，其活性形式由2个4个60ku70ku同样的亚单位组成，与许多微生物的苹果酸酶高度同源。 4.影响mlf的因素

9、 4.1 ph 影响mlf的最主要的因素是ph，其影响除提供质子梯度外，它决定哪些种类的lab会出现，影响生长的速率，当ph低至一定程度时(lab对so2非常敏感，比酵母敏感的多。所有lab具有相同的敏感性，酒球菌中没有耐受性菌株。so2分子或其游离形式是其抑制剂形式。游离so2的出现取决于ph，结合的so2也对lab有抑制作用，但作用较小。酵母产生一定量的so2，产生的亚硫酸盐量在20mgl以上，如果ph条件合适足以抑制lab的生长。酒类酒球菌对亚硫酸盐的耐受性达30mgl,对低ph耐受的菌比不耐受的菌生存的更好。在酸性培养(ph3.5)中的适应性阶段加入亚致死浓度的亚硫酸盐(15mgl)，

10、增加lab对亚硫酸盐的适应性。 4.3 营养成分 lab比酵母对营养的要求高，要求许多微量元素和生长因子，这就是酵母的降解可以刺激苹果酸乳酸转化的原因。和酵母比较,细菌要求一些氨基酸的出现，即它们不能利用氨合成所有20种氨基酸。不同菌株对氨基酸的要求不同。酵母在发酵的后期释放氨基酸，所以氨基酸的限制不再是一个问题。有观察到在酵母发酵之前或发酵之后更易发生苹果酸乳酸转化，但如果在乙醇发酵活跃期接种，这种转化很少发生。在葡萄酒乙醇完全发酵后残留的主要糖是葡萄糖和果糖，根据发酵方式的不同含量为10gl,到少于0.5gl。果糖的浓度通常比葡萄糖高，尽管在酒类酒球菌更易利用葡萄糖，但果糖是最高效的代谢糖

11、类，和葡萄糖共代谢可以导致产生最大的生物量。果糖不仅被异型发酵途径发酵，而且可以被甘露糖脱氢酶作用下变为甘露糖。葡萄酒中葡萄糖和果糖之外的其他糖类的浓度可达1.3gl，这些糖对酒类酒球菌生长的作用依菌株而异 4.4 氧和二氧化碳 分子氧对mlf的作用取决于微生物的种类，其刺激一些lab的生长机理和酵母相似。葡萄酒生产时，有限的氧化作用似乎刺激mlf，然而，如果氧含量太高，并且如果有专性异型发酵微生物，可能导致产生醋酸。因此，在mlf中应限制进行通风操作以避免不期望的终产物的出现。lab具有发酵代谢途径，在有氧的条件下通常生长不好。然而，一些明串珠菌菌株有氧培养时由于诱导性nad(p)h一氧化酶

12、的出现，生长良好。这些酶使得细胞从乙酰磷酸转变为醋酸获得atp。其他lab，如植物乳杆菌和乳酸乳杆菌从氧气不能获得益处，但氧气的出现也不抑制它们。严格的厌氧条件促进酒类酒球菌的生长，在充气条件下以葡萄糖作为惟一碳源不生长。氧使乙醇形成过程中的酶，乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶失活，因此，阻止异型乳酸发酵糖分解第一阶段中产生的辅酶的再氧化。而且，酒类酒球菌在有氧条件下缺乏重要的nad(p)h一氧化酶活性，这些结果表明，对葡萄糖的有氧代谢辅酶的产生是限制性因子。加入果糖或丙酮酸，作为电子受体，轻微促进酒类酒球。 菌的生长。果糖转变为甘露糖，氧化两分子的nad(p)h，丙酮酸转变为乳酸，使nad+再生。co2刺激lab的生长，但其机理不清。 4.5 乙醇 lab对乙醇的耐受性有一定的限制。一般情况下乙醇浓度为14时lab被抑制，但有的比较敏感。如果用晚收的葡萄或高自利糖度果汁进行mlf，需要在乙醇发酵前进行。一般而言，乙醇浓度越高mlf越慢。乙醇对lab的苹果酸乳酸代谢有强烈的干扰作用，高的乙醇浓度降低lab的最低生长温度，升高温度则降低乙醇耐受l生。尽管在葡萄酒中的乙醇浓度(8一12，体积分数)不抑制mlf，但酒类酒球菌的生长速率随乙醇浓度的增加呈线性降低，14是大部分菌株乙醇耐受性的上限