《hpv培训》PPT演示课件

1、,HPV分型检测在宫颈疾病检查中的应用及亚能HPV基因分型检测,HPV发展进程,70年代德国人哈拉尔德楚尔豪森提出 人乳头瘤病毒与宫颈癌有关系 1995年国际癌症学会确定：人乳头瘤 病毒是宫颈癌的主要病因。 2008年10月6号哈拉尔德楚尔豪森获 得诺贝尔奖。,宫颈癌生物学病因研究的进程,子宫颈癌,唯一病因明确 唯一可以早期发现和治疗 唯一可望消灭 HPV感染，特别是高危性、持续性感染引起子宫颈癌前病变，子宫颈上皮内瘤变，CIN和宫颈癌 预防HPV感染就可以预防宫颈癌 没有HPV感染就可以不罹患宫颈癌,我国宫颈癌流行现状,我国妇女患宫颈癌的比例15/10万，是仅次于智利的宫颈癌高发国家 目前患

2、者约40万，每年新增15万，据女性生殖道肿瘤首位 我国的宫颈癌死亡率为11.34%，据女性癌症死亡率第二位，特别在西部地区，宫颈癌居女性癌症死亡率之首 我国已婚女性HPV感染率在10%左右。我国需惊醒宫颈癌相关筛查的适龄女性，不少于1亿,HPV 病毒学基础知识,小环状双链 DNA 病毒 2. 直径 50-55nm 3. 癌基因E6E7,14,66,低危型HPV,高危型HPV,HPV16,L1: 主要衣壳蛋白，是疫苗的主要成分,L2: 次要衣壳蛋白，是市售抗体的主要识别位点,E4：结合并破坏细胞角蛋白网，形成挖空细胞的外观,E2：负性调节E6和E7，维持凋亡和细胞周期的调控。 通常在病毒发生整合

3、（病毒整合时会破坏E2基因的结构）时失活,HPV 的主要致癌基因 E6 通过抑制 p53而阻断凋亡 E7 通过抑制pRB使细胞周期失控,X,生殖道HPV 感染,高危型HPV感染通常没有症状，为一过性并可自愈。90% 以上的病人两年内可痊愈。 常见其他亚型继发或并发感染 多重HPV亚型感染极为常见 自然免疫力差 感染后只有50%-60%的女性产 生抗HPV抗体，因此对同种基因型的HPV可再度 感染！,E6348:518-27,Luminex 100TM多功能流式点阵仪,流式荧光杂交法 - 不定量,流式荧光杂交法总结,结合普通PCR技术，核酸分子杂交技术和荧光标记 技术尚不成熟，灵敏度和特异性有待

4、提高 无洗涤步骤，无法去除非特异性杂交，且有背景荧 光信号干扰 技术难点为探针与微球的交联，产品性能上存在不 稳定性 只分型，不定量 需价格昂贵的流式荧光检测仪,（二）二代杂交捕获 Hybrid Capture 2, HC2,基本原理：利用对抗体捕获信号的放大 和化学发光信号的检测 检测通量：13种高危HPV基因型, 不能提示具体的基因型,计算机 判读 15 min,杂交 60 min,抗体 捕获 60 min,第二抗体结合， 化学发光 30 min,DNA 变性 45 min,HC2 实验步骤图示,吸取变性剂于对照和样本管中,旋涡振荡10秒,65孵育45分钟，采用Microplate hea

5、ter I,HC2操作步骤-DNA 变性,将已变性的样本混匀，吸取75 ul 于“杂交微孔板”中,20-25孵育10分钟,加入25 ul 高危HPV探针于微孔板中,65孵育60分钟,置于Rotary Shaker I中，1100 rpm，32分钟,准备HPV 探针混合物,HC2操作步骤-杂交,将杂交产物转移至“捕获微孔板”相应的小孔中,20-25孵育30-45分钟,20-25孵育60分钟， 1100 rpm,加入75 ul Detection Reagent 1（碱性磷酸酶偶联的抗体） 于“捕获”微孔板相应的小孔中,HC2操作步骤-抗体捕获及酶标,洗涤微孔板：采用Automated Plate

6、 Washer I 或进行手动洗板，重复洗6次,加入75 ul Detection Reagent 2 （化学显色底物） 于“捕获”微孔板相应的小孔中,20-25孵育15-30分钟,采用Digene microplate luminometer (DML2000)读数,HC2操作步骤-洗板及化学显色,HC2如何进行结果判读?,1 、阴性对照 每次实验必须同时做3份阴性对照。阴性对照的结果必须为10-250 RLU（相对光单位）。变异系数（%CV）应该25%，如果25%，那么去掉偏离平均值最远的一个阴性对照，用剩下的两个阴性对照计算平均值以及变异系数。 %CV必须25%，否则，本次实验结果无效，

7、必须重做，无法给病人出报告,2. 标准品 每次实验必须同时做3份高危HPV标准品。 %CV应该15%，如果15%，那么去掉偏离平均值最远的一个标准品，用剩下的两个标准品计算平均值以及变异系数。 %CV必须15%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告 3. 用标准品平均值（MHRC）以及阴性对照平均值MNC计算MHRC/ MNC比值.2.0MHRC/ MNC 15。如果2.0 或15，本次实验结果无效，必须重做。 4. 如果符合以上的标准，检测结果是可靠的。此时的Cutoff值（阳性标本评判的标准）就是MHRC,Cutoff 值=318， 所有标本的相对光单位（RLU）应该转换为与

8、Cutoff值的比值， 比值大于1为阳性，比值小于1则为阴性,阳性结果的判定,质 控,HC2技术总结,技术上，采用核酸分子杂交，抗体捕获（吸附杂交体），化学显色 不分型 不能检测HPV多重感染 不定量 有交叉杂交反应 每次需要消耗8个参考品，试剂成本高 手动操作很多，步骤繁琐 需价格昂贵的基因杂交信号放大系统,(三) 荧光定量PCR技术,原理： 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监控整个PCR过程,最后通过标准曲线对起始模板量进行定量分析. 定量，不分型,荧光基团的分类,化 学 原 理,荧光定量PCR-基于Taqman探针,化 学 原 理,荧光定量PCR技术总结,能定量检

9、测HPV拷贝数 灵敏度高 不分型 不能检测HPV多重感染 检测通量有限，目前最多检测13种高危型 需价格昂贵的荧光定量PCR仪,（四）原位杂交,采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针， 依据碱基互补配对原理，与组织切片、细胞涂片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大及显色后，显微镜下观察结果,原位杂交试剂盒,代表厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司,原位杂交实验步骤,以地高辛标记HPV DNA探针为例 4-6mm切片，用处理过的玻片捞片。 56-60烤片，2-16小时。 新鲜二甲苯脱蜡，10分钟2次。 100%乙醇5分钟2次，空气干燥。 加入50ml胃酶工作液，37消化30分钟。 弃去胃酶工作液，逐

10、级酒精脱水1分钟3次，空气干燥。 加10-20ml探针，加盖玻片。用橡胶水泥将盖片周围密封（目录编号ZLI-9601）。 变性95 5-7分钟。 杂交37 2-16小时。 揭去橡胶水泥，将切片插入PBS/TBS缓冲液中以便去掉盖玻片，约5-10分钟。 每张切片加入2-3滴杂交后洗液，37孵育15分钟。 PBS/TBS缓冲液洗，1分钟3次。 每张切片加入适量辣根酶标记抗地高辛抗体，37孵育30分钟。 PBS/TBS缓冲液洗，1分钟3次。 滴加适量DAB工作液，镜下观察显色结果，约3-10分钟。 弃去显色液，蒸馏水或自来水冲洗。 选择：每张切片加入1滴复染剂，5-10秒钟。 蒸馏水或自来水冲洗。

11、脱水、透明、封片。,原位杂交技术总结,灵敏度低（无PCR扩增） 特异性高 检测通量低 不能分型 不能定量 操作步骤繁琐 非常费时，需要两天 HPV 检测产品无注册证，仅仅用于科研,（五）表面等离子体谐振 （SPR） 技术,93,表面等离子谐振现象,Surface Plasmon Resonance，SPR 入射光(单波长偏振光)在玻片-金膜界面全反射，激发金膜中的自由电子产生表面等离子体。 当光波激发频率与表面等离子体的振动频率相等时，二者发生谐振，光能被吸收,反射光几乎完全消失,此时入射光的角度被称作SPR角（谐振角）。,SPR检测核酸原理示意图,反应曲线,Time(s),SPR角(m),1

12、）核酸提取试剂 2）PCR反应试剂 3）SPR检测试剂和芯片,北京金菩嘉-HPV分型检测试剂盒组成,HPV基因检测芯片，共26个通道，一个阴性，一个IC，24个hpv探针,通道 217： 高危HPV; 通道 1825：低危HPV,SPR检测芯片探针点阵,SPR HPV 检测芯片,SPR技术检测 H P V流程图,样品制备,DNA,PCR,扩增产物,线上检测,输出报告,成品芯片,SPR 设 备 简 介,W2600型生物传感芯片阅读仪,W2600工作流程,开始检测后系统自动进行以下动作：,SPR技术检测HPV 总结,同样需要DNA 提取 采用普通PCR扩增，核酸分子杂交 采用SPR技术（物理手段）检测杂交信号 无临床应用文献 无注册证,（六）HPV DNA