8.PCT主要生产工艺及反应体系的研究资料

1、广州鸿琪光学仪器科技有限公司.广州鸿琪光学仪器科技有限公司降钙素原（PCT）检测试剂盒（胶体金法）主要生产工艺及反应体系的研究资料胶体金免疫检测技术是目前临床快速检测的常用方法之一。广州鸿琪光学科技有限公司结合国内外对降钙素原检测试剂盒在临床诊断中的应用情况开发了降钙素原（PCT）定量检测试剂盒（胶体金法），结合鸿琪公司开发的免疫胶体金读数仪对血清、血浆和全血标本中的降钙素原（PCT）进行定量检测。一、 反应原理描述人降钙素原（PCT）检测试剂（胶体金法）是一种不需要任何仪器设备的全血/血清/血浆检测法，采用胶体金免疫层析技术，试剂盒含有被预先包被在玻璃纤维上的胶体金标记的抗PCT单克隆抗体(

2、mAb1)以及固定于膜上测试区（T）的抗PCT单克隆抗体(mAb2)和质控区（C）的相应抗体。测试时，将标本滴入试剂盒加样孔（S）内, 标本中如含有人降钙素原（PCT），则标本中的人降钙素原（PCT）分别与预先包被在玻璃纤维上的抗PCT单克隆抗体(mAb1)结合，结合物在毛细效应下向上层析，随后会被固定在膜上相应测试区的抗PCT单克隆抗体(mAb2)结合捕获，从而在相应测试区出现紫红色条带。如是阴性标本，则相应测试区内将没有紫红色条带出现。无论标本中是否存在人降钙素原（PCT），一条紫红色条带都会出现在质控区（C）内。质控区（C）内所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准

3、，同时也作为试剂的内控标准。通过金标免疫分析仪检测测试区（T）显色深度，再经过保存在卡壳上二维码上的定标曲线计算得到检测结果。胶体金标记的基本原理是胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金标记所用的主要原辅料有：抗PCT单克隆抗体(mAb1)、氯金酸、柠檬酸三钠，玻璃纤维。NC膜包被的基本原理是蛋白首先通过静电作用和硝酸素纤维膜结合，然后靠H键和疏水作用维持长时间结合。NC膜包被所用的主要原辅料有：硝酸素纤维膜、抗PCT单克隆抗体(mAb2)和羊抗鼠IgG。二、主要生产工艺的各主要工序流程图蓝色工序在10万

4、级洁净区内进行，其他工序在普通生产区。领 料配包被用液体配标记用液体配包被溶液标记包 膜稀释金标交联溶液喷 金晾 干 干 燥No不合格品控制不合格品控制半成品检验半成品检验NOYesYes入 库入 库组 装NO o放 行成品检验不合格品控制总 装定 标Yes三、主要工序所用主要原辅料、具体步骤即每一步骤的具体实现方法该产品的生产工艺包括各种工作溶液的配置，胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定，胶体金标记物制备，检测线及质控线的制备等步骤，并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合产品质量标准。（一）各种工作溶液的配置1 配标记用液体：胶体金制备：0.01%氯金酸（HAuCl

5、4），水溶液100ml加热至沸腾，加入1%柠檬酸三钠1ml，混匀，煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却即可。2 配金标记物干燥基础液包被缓冲液为10mM Tris-HCl，1.0%BSA, 0.01% NaN3，2%蔗糖。3 配包被用液体包被缓冲液为10mM Tris-HCl，2%蔗糖。4 配包被溶液对照线包被羊抗鼠IgG,包被浓度1.0mg/ml检测线分别包被抗PCT单克隆抗体(mAb2)，包被浓度均为1.0mg/ml喷量1.0l/cm，电机速度511HZ，。（二）胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定1、胶体金标记物：分别以20ug/ml最终浓度将抗PCT单克隆抗体(mAb1)

6、加入胶体金溶液中进行标记。2、检测线包被抗原浓度：用包被缓冲液稀释抗PCT单克隆抗体(mAb2)，终浓度均为1.0mg/ml。3、对照线包被浓度：用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG，终浓度为1.0mg/ml。（三）胶体金标记物的制备采用枸橼酸三钠还原法制备胶体金，选择30nm胶体金颗粒用于标记，分别以20mg/ml最终浓度抗PCT单克隆抗体(mAb1)加入胶体金溶液中。快速搅拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。分别加入20%BSA，搅拌5分钟，离心6分钟（4000转），吸去上清，沉淀以金标记物干燥基础液（原胶体金溶液体积的1/10）重新悬浮。置2-8保存，在规定的保存期内使用。以金标记物干燥基础液对金标抗

7、PCT单克隆抗体(mAb1)进行按一定比例稀释， 然后利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量1.0l/cm，喷笔口径为10mm，将喷好的玻璃纤维放置烘房中，372，干燥24小时。（四）检测线及质控线的制备 取抗PCT单克隆抗体(mAb2)终浓度分别为1.0mg/ml，喷量1.0l/cm，电机速度511在硝酸纤维素膜上制备检测线，室温干燥；取已确定使用的用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG，终浓度为1.0mg/ml，用同样方法制备控制线。检测线与控制线在NC膜上之间的距离约3.5+0.5mm，线的宽度约0.8-1.0mm；前后均匀；并置温度1526；温度30%；干燥24小时以上。（五）半成品检验按批号抽取一定数

8、量的半成品检测，对所抽样的半成品做准确性、最低检出量、线性、精密性、稳定性等性能方面的检测，应符合质量标准。（六）贴板、切条、装卡 在温度1530；湿度25%条件下，将标记好的玻璃纤维、硝酸纤维膜、聚纸板、吸水纸、样品垫（经特殊处理，可过滤红细胞）等物组装，要求材料附着牢固，膜条切割应宽为4.01.0mm，然后装塑料壳。（七）定标利用公司内部校准品对试剂进行定标，定标曲线保存到二维码中。(八)组装1）把二维码贴到试剂卡壳上，并将干燥剂、吸管等装入铝箔袋，封口。2）装盒。（九）成品检验成品做准确性、最低检出量、线性、精密性、稳定性等性能方面的检测，应符合质量标准。四、主要工艺的确定1 检测线包被

9、浓度试验设计：固定加液量（喷量1.0l/cm，电机速度511HZ），用包被缓冲液调整抗PCT单克隆抗体(mAb2)的包被浓度分别为0.3 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ ml、2.0 mg/ ml，分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次，。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0及计算它们的标准差SD，计算0.1ng/ml参考品的测试平均值为M1，若M1M0+2SD，表明最低检测限0.1ng/ml（95%置信区间）。试验结果：包被浓度M0+2SDM10.3mg/ml0.

10、5mg/ml1.0mg/ml2.0mg/ml2.5mg/ml结论：当包被浓度分别达到1.0mg/ml， 最低检测限0.1ng/ml，而进一步提高包被浓度，这个项目的灵敏度没有明显的改变。最终确定这个项目检测线包被浓度均为1.0 mg/ml。2 对照线包被浓度试验设计：固定加液量（喷量1.0l/cm，电机速度511HZ），用包被缓冲液调整羊抗鼠IgG抗体浓度为0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.4 mg/ml、1.8mg/ml，分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，以阴性标本加样比较不同包被浓度对照线显色时间。试验结果：羊抗鼠IgG对照线显色时间0.5mg/m

11、l超过4 min0.8mg/ml超过4 min1.0mg/ml2min1.5mg/ml2min2.0mg/ml2min结论：包被浓度达到1.0mg/ml,，对照线即在2 min内清晰可辩，符合设计要求。最终确定对照线包被浓度1.0mg/ml。3 胶体金标记抗PCT单克隆抗体(mAb1)的制备3.1胶体金与标记蛋白用量之比的确定试验设计：将胶体金分装15管，每管1ml，每个项目5管。将抗PCT单克隆抗体(mAb1)分别以5g/ml、10g/ml、20g/ml、30g/ml、40g/ml浓度加入上列胶体金溶液中，快速搅拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。加20%BSA，搅拌5分钟，离心6分钟（10000

12、转），吸去上清，沉淀以金标记物干燥基础液重新悬浮。以金标记物干燥基础液对金标抗PCT单克隆抗体(mAb1)进行按一定比例稀释， 然后利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量1.0l/cm，喷笔口径为10mm，将喷好的玻璃纤维放置烘房中，372，干燥24小时。按正常生产工艺组装试剂条。分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0及计算它们的标准差SD，计算0.1ng/ml参考品的测试平均M1，若M1M0+2SD，表明最低检测限0.1ng/ml（95%置信区间）。

13、比较不同标记蛋白用量的灵敏度高低。包被浓度M0+2SDM10.3mg/ml0.5mg/ml1.0mg/ml2.0mg/ml2.5mg/ml结论：当标记浓度分别达到20g/ml, 试剂盒能满足最低检出量参考品0.1ng/ml检出要求，而进一步提高包被浓度，这三个项目的检测线显色程度没有明显的改变。最终确定标记浓度均为20g/ml。3.2金标抗PCT单克隆抗体(mAb1)稀释浓度的确定试验设计：将抗PCT单克隆抗体(mAb1)用金标记物干燥基础液按1：1、1：2、1：3比例进行稀释，稀释好后按固定喷金参数，将金标抗PCT单克隆抗体(mAb1)喷在 玻璃纤维上，干燥，按正常生产工艺组装试剂条，分别以

14、降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0及计算它们的标准差SD，计算0.1ng/ml参考品的测试平均M1，若M1M0+2SD，表明最低检测限0.1ng/ml（95%置信区间）。比较不同标记蛋白用量的灵敏度高低。稀释浓度M0+2SDM11:11:21:3结论：只有当稀释度达到1：1时，最低检测限0.1ng/ml，符合设计要求。最终确定金标单抗稀释度为1：1。4 设计定型通过以上实验，我们确定采用的生产工艺为：（1） NC膜包被：检测线：用包被缓冲液稀释抗PCT单克隆抗体(mAb2)到终浓度为1.0m

15、g/ml。对照线：用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG，终浓度为1.0mg/ml。包膜参数：喷量1.0l/cm，电机速度511HZ。将包被好的NC膜放置烘房中，372，干燥24小时。（2）胶体金标记：以20mg/ml最终浓度将抗PCT单克隆抗体(mAb1)加入胶体金中。快速搅拌1分钟，再慢速搅拌15分钟。加20%BSA，搅拌5分钟，离心6分钟（4000转），吸去上清，沉淀以金标记物干燥基础液重新悬浮。然后用金标记物干燥基础液分别按1：1进行稀释，然后利用喷金仪喷到玻璃纤维上，喷量1.0l/cm，喷笔口径为10mm，将喷好的玻璃纤维放置烘房中，372，干燥24小时。按正常生产工艺组装试剂条。成品检验方案

16、：组装成的试剂条是否在15分钟内检出降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml。成品检验结果：组装成的试剂条能在15分钟内检出降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml。结论：该生产工艺生产出来的试剂条符合我们的产品要求，确认为以后采用的生产工艺。五、质控标准及内部质控品的确立1. 企业标准的制定的缘由由于目前人降钙素原的检测尚无一个统一的国家标准或国际标准，我们参考已上市的人降钙素原检测试剂盒产品的性能指标，设计了本品的企业内部标准，制定了内部校准品和质控品。2.质控标准2.1 准确性标准：取PCT零浓度参考品，作为基础样本，将其等体积分为4份，在任意3份中添加PCT纯分析物，使加入浓度分别为5

17、ng/ml、15ng/ml、40ng/ml，制成3份回收样本，分别计算其回收率，然后计算平均回收率，平均回收率应95%。2.2 最低检测限标准分别以降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0及计算它们的标准差SD，计算0.1ng/ml参考品的测试平均M1，若M1M0+2SD，表明最低检测限0.1ng/ml（95%置信区间）。最低检测限必须0.1ng/ml。2.3线性标准用50ng/ml的高浓度参考品和0.1ng/ml的低浓度参考品，混合成8个稀释浓度（Xi），每个浓度测定3次，分别求出检测结果均值即

18、为实测值（Yi）。以稀释浓度（Xi）为自变量，以检测结果实测值（Yi）为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数（r）及线性相对偏差，要求线性相关系数r0.975，线性相对偏差不超过15%。2.4精密性标准批内：用同一批次试剂盒分别对企业内部1ng/ml和40ng/ml PCT参考品进行检测，各平行测定10次，批内变异系数CV15%。批间：取三个不同批次的产品，分别测定企业内部1ng/ml和40ng/ml PCT参考品，每个批号重复检测10次，批间变异系数CV20%。3. 内部质控品的制备3.1 最低检出量质控品的制备和验证3.1.1 降钙素原零浓度质控品的制备和验证 制备方法：10份经确认PCT为阴性、无肉眼可见的溶血、黄疸、乳糜颗粒，HIV抗体、HBV抗原、HCV抗体检测均为阴