《生物化学实验食品》PPT课件.ppt

1、生物化学实验,生物化学实验内容,1、 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质 2、双缩脲测定蛋白质的含量 3、 血液葡萄糖的测定 4、 牛乳酪蛋白提取与鉴定 5、 维生素C的提取与含量的测定 6、 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 7、 酶的基本性质 要求：课前预习，试验中做记录，课后写实验报告。 两人一组，离开实验室时签字。,实验一 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳,一、目的： 了解电泳技术基本原理，掌握醋酸纤维薄膜电泳操作技术。 二、原理： 蛋白质是两性电解质，在非等电点状态下在电场中会向一定电极移动。在碱性条件下多数蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动 ， 不同蛋白质由于大小、所带电荷及形状不同，在电场中的迁

2、移率不同，经过电泳可将其分开，结果经染色、漂洗，得电泳图谱。 材料 ：血清,pH8.6 巴比妥缓冲液 滤纸吸去膜上液体 醋酸 浸泡点样 纤维薄膜 10min 沾血清点在无光泽面上 2mA/条膜 染色液 漂洗液 电泳 染色 漂洗 40min 5min 浸泡漂洗数次 观察电泳谱带,三、步骤：,电泳装置,点样,实验二 双缩脲测定蛋白质含量,一、实验目的 掌握双缩脲测定蛋白质的方法和原理 二、实验原理 双缩脲在碱性溶液中与Cu2+产生紫色的络合物,这一反应称“双缩脲反应”。蛋白质分子中肽键，也能与Cu2+ 发生双缩脲反应，溶液紫色的深浅与蛋白质含量在一定范围内成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关

3、。该紫色的络合物在580nm处有最大吸收值。,三、实验步骤,1、标准曲线制作（已制好） 2、样品测定,3、结果计算,100,=,豆粉（g）,样品蛋白质含量（%）,标准曲线上查得蛋白质含量（g）,实验三 血液葡萄糖的测定,一、实验目的 学习和掌握Folin-吴宪法测定血糖的方法 二、实验原理,三、实验步骤,四、计算,实验四 牛奶中蛋白质的提取与鉴定,一、实验目的 学习从牛奶中制备酪蛋白的方法并进行鉴定试验 二、实验原理 蛋白质等电点 沉淀 三、实验步骤 1、酪蛋白的制备,鲜牛乳3Oml（40）+3Om醋酸缓冲液（40）,边加边摇动,离心3000r/5min,冷却至室温，继续放置5分钟,清液（乳清

4、）,沉淀,加热观察现象,醇醚混合物洗2次,沉淀,清液,晾干，鉴定,弃掉,2、酪蛋白的性质鉴定,（1）溶解度观察,2.米伦反应：,少许酪蛋白+lml H2O+米伦试剂10滴， 振摇，加热 观察其颜色变化,3.含硫 (胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)测定: 少量酪蛋白+lmlO.1M NaOH+ 5%醋酸铅1-3滴,观察现象,煮沸,实验五 维生素C的定量测定（2，6-二氯酚靛酚滴定法）,一、实验目的 掌握滴定法测定Vc含量的原理和操作。 二、实验原理,三、实验步骤,1.提取: 2.0克松针（2份）+少量 2%草酸 匀浆 过滤后用2%草酸定容到50毫升 （也可先定容后过滤或离心）,2、滴定,（1）标定染料

5、（标准维生素C液滴定）：准确吸取标准维生素C溶液10毫升（含1.0毫克维生素C）置100毫升锥形瓶中，用微量滴定管以0.1%2，6一二氯酚靛酚滴至淡红色出现，15秒钟不退色即为滴定终点。记录所用染料体积计算出1毫升染料相当于多少毫克维生素C（K值），即1/染料ml。 (2)样液滴定:准确吸取滤液10毫升放人100毫升锥形瓶内，滴定方法同前(做两次平行试验)，记录染料体积。 (3)空白液滴定：准确吸取10毫升2%草酸溶液，放入100毫升锥形瓶中，用上述方法滴定至终点，记录所用染料体积。（滴定过程宜迅速，一般不超过2分钟）,X ：100克样品所含维生素C毫克数 W ：称取样品毫克数 V1：滴定样品

6、所用染料毫升数 V2：滴定空白所用染料毫升数 V3：样品测定时所用滤液毫升数（即10毫升） V ：样品提取液稀释至总体积（即50毫升） K ：1毫升染料所能氧化维生素C之毫克数，可由标定算出,3、计算,实验六 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察,一、实验目的 了解琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制剂对其活性的抑制。 二、实验原理,甲烯白,三、实验步骤,1、酶的制备 猪心1.52g +1/15M磷酸氢二钠溶液34ml 匀浆 1/15M磷酸氢二钠溶液67ml，放置30min 2000r/min 离心10min，取上清备用。,加好混匀，立即在各管中加入一层（约8滴）液体石蜡油，置37度恒温水浴保温

7、30分，观察各管颜色变化，分析原因。然后用力振摇1号管，观察变化记录并解释。,2、酶促反应,实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响,一、目的： 了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响,二、实验原理,以唾液淀粉酶为例，观察温度、pH、激活剂和抑制剂对其活性的影响。唾液淀粉酶可水解淀粉生成糊精、麦芽糖、葡萄糖等物质。淀粉遇碘呈呈蓝色。糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 酶具有极高的催化效率，过氧化氢酶比铁粉的催化效率高出许多倍。,三、操作步骤 （一）温度对酶活性的影响 （唾液淀粉酶的制备：取漱口水

8、0.5Ml，稀释至50ml，以下简称酶液） 1、 取3支试管，编号后按下表操作,2、在比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应液1滴与碘混合，观察颜色变化。 3、待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化时，向各管中加入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，做出解释。,二、pH对酶活性的影响 取试管5支，编号， 按下表操作。,摇匀，37水浴中保温。每隔l分钟从pH 6.8的管中（2号）取出1滴于白瓷板上，加碘液1滴，观察淀粉水解的程度。待颜色不变时，向各管中加碘液1-3滴。观察颜色，比较水解程度，做出解释。,三、酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 （氯离子是唾液淀粉酶的激活剂，铜离子是抑制剂）：取小试管3支，按表操作,将3支试管放入37水浴中，在比色板上用碘液检查第2管，待不变色时向各管中加碘液1滴，记录颜色并解释。,四、酶的高效性 酶具有极高的催化效率，比普通催化剂活性高出很多倍。过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为二氧化碳和水，铁粉也能催化此反应，但二者的催化效率有很大差距。取小试管4支，编号，按下表操作。,恒温水浴锅,电磁炉水浴锅,电子天平,需冷藏、冷冻试剂和材料放在冰柜和冰箱,注意,生物材料及试剂在冰箱中，取完放回原处。 请勿将固体物