《干细胞的概念》PPT课件.ppt

1、,异体移植脐带血救活白血病男孩的故事,她只是11个月大的上海女婴贝贝，而他却是身患骨髓增生异常综合征（俗称白血病前期），躺在淮安市第一人民医院血液科病床上处于生死边缘的6岁盐城男童周银宝。素不相识的两个人，却因小银宝的病情而血脉相连： 2009年8月24日，贝贝的自留脐带血被从上海紧急送到淮安市，输入小银宝的体内。 手术后两个月的观察发现，小银宝有皮疹这样的排异反应，属于轻度正常。从整体情况看，造血功能正常运转，可以初步肯定，移植手术是成功的。 这是淮安市首例脐带血干细胞成功移植的病例，也是我国首例自留脐带血异体移植成功案例。,自体脐带血造血干细胞移植术获成功的案例,2008年刚刚一岁的源源被

2、诊断患有神经母细胞瘤且到了晚期，经手术和化疗后，决定为他进行自体造血干细胞移植术以提高生存率。2009年4月源源在北京儿童医院接受了自体脐带血造血干细胞移植。目前源源造血功能已恢复，肿瘤已全部消失。,裸鼠背上成功复制“人耳”,干细胞研究的重要性：,美国Science杂志 1999年，将“干细胞研究的新发现”列入十大科技进展之首 2000年，再次入选年度十大科技进展 2002年，列入值得关注的六大科技领域之一 至今，干细胞各领域的研究飞速发展,美国加州每年提供干细胞研究经费达3亿美元,我国有关干细胞的研究也十分活跃，已有多个有关干细胞的“973”项目，召开过多次全国性或国际性学术会议，出版过多本

3、专（译）著。“863”计划近期将为干细胞研究提供2亿元人民币的经费。,目 录,干细胞的概念 干细胞应用的基础调控 干细胞应用平台技术 干细胞技术的市场前景 干细胞大事记 国外相关网站,干细胞的概念,干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。 胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力 成年组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。,干细胞向神经细胞分化,干细胞是生命的主宰！,干细胞的分类及特点：,胚胎干细胞 成体干细胞 诱导分化干细胞（iPS）,1.1 胚胎干细胞（Embryonic Stem cell, ES细胞）,当受

4、精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。 进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。,1.2 成体干细胞,成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； 永生化(immortal

5、)； 能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； 有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； 能参与胎儿所有组织的发育过程；,胚胎干细胞的性质,胚胎干细胞系的建立过程,ES细胞研究的趋势,改善ES细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得ES细胞的方法。 定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。 成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，成体干细胞能否替代胚胎干细胞？,胚胎干细胞的特点,增殖速度：1824h分裂增殖一次 hES必须在含有白血病抑止因子（LIF）的培养基及成纤维细胞饲养层(freeder cell)条件下才能保持繁殖而不分化。 hES体外

6、培养要解决的关键问题是维持细胞的分裂增殖而抑止其分化。 具有分化形成外、中、内三个胚层的潜能。 能形成嵌合体动物，从而成为联系细胞和个体之间的桥梁。,注：人胚胎干细胞具有自我更新和多潜能的特性，以及以下一些特征： 1）可以从囊泡的内细胞团中分离出来；2）在体外的增殖力非常强；3）在继代的培养过程中保持正常的多倍体核型；4）可以分化为三个胚层的细胞；5）具有端粒酶活性,内细胞群的细胞可以发育成除了胎盘以外的完整个体，因而这些细胞被认为具有全能性。,胚胎干细胞的优点 全能性,ES细胞的全能性主要体现在以下几方面：,形成畸胎瘤。将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞； 形成类胚体。

7、培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三个胚层组织； 直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞； 形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。,ES细胞生物学特性,细胞形态结构及核型 细胞的高度分化潜能 碱性磷酸酶的表达 胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表

8、达,1. 各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。 2. ES细胞与卵圆柱期（egg cylinder stage）胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似，而与 ICM细胞有差异。 3. 细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。 4. ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。 5. ES细胞增殖迅速，每1824 h分裂增殖 1次。 6

9、. 此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。,1、ES细胞形态结构及核型,2、ES细胞的高度分化潜能,ES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点 1. ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。 2. 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞， 悬浮培养中： “简单类胚体” “囊状胚体” 细胞分化物。 3. ES细胞可进行诱导分化 *用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90以上的ES细胞分化为神经胶质细胞。 *聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律

10、性收缩的心肌细胞。 *将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。 *用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。,3.碱性磷酸酶的表达,许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。,4、胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达,早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞

11、、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA1的表达。小鼠SSEA1的表达自8一细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。,ES细胞的应用前景,（1）ES细胞在动物克隆及人类治疗性克隆中的应用 （2）在转基因动物中的应用 （3）制备嵌合体动物,ES研究面临的难题,1、体外培养ES 细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态。如何平衡这一对矛盾, 必须筛选适宜的培养条件。目前在ES细胞研究中存在着建系成功率也不高等问题, 只在小鼠中建立了稳定的ES细胞系，家畜、人类

12、细胞系建立的最佳条件仍无定论。,2、ES 细胞高度未分化, 具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用ES 细胞进行治疗前必须首先体外诱导ES 细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因, 当移植的细胞向肿瘤发展时, 自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。但如何诱导ES细胞定向分化成单一类型的分化细胞, 是至今仍未解决的难题。因此，必须寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法，以及不同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组织。,3、ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程, 很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育完整的来自自然机

13、体的器官, 要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到, 器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。,4、最大的障碍来自于伦理学问题，特别是ES细胞应用受到伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类ES细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响，但随着观念的改变，人们会逐渐认识到ES细胞对临床医学及生物学理论研究的重要作用。,另外，利用胚胎干细胞进行克隆性治疗在目前尚受到多方面的限制 胚胎干细胞诱导分化的条件及分化成熟的鉴定标准尚不成熟，人们对如何避免分化不完全的胚胎干细胞在体内导致畸胎瘤

14、的危险性仍不清楚,人ESC用于临床的疾病治疗短期内将难以实现,解决胚胎来源有限的途径： 未成熟卵的体外成熟,（1）Knock-out 胚胎干细胞的组织相 容性抗原 （2）Knock-in 受者的组织相容性抗原 （3）与同一来源的造血干细胞一同移植 （4）受者的体细胞核移植,避免免疫排斥的方法,分离、纯化：随着对胚胎干细胞研究的进展，分离、纯化技术得到较好的解决。,伦理学问题的解决：,诱导产生多能性干细胞（IPS）的研究，充分解决了胚胎干细胞所面临的伦理学问题。,诱导产生多能性干细胞的研究,细胞重编程的研究概况,核移植：核移植试验最初是在两栖动物中实现的，通过将体细胞核注入到去核卵母细胞中，但具

15、有很大的局限性。 将成熟的体细胞与多潜能的细胞（ES细胞、胚胎癌细胞等）融合，或者用胚胎干细胞提取物来处理体细胞，也可以在一定程度上使体细胞发生重编程。但面临许多伦理学问题。,有没有相对简单，又可摆脱材料来源和伦理学诸多限制，重编程的效率和程度都十分可观的新方法呢？,2006年11月20日，日本京都大学的山中伸弥（Shinya Yamanaka)和美国威斯康星大学的詹姆斯汤姆森（James Thomson）分别在细胞和科学杂志上发表重量级论文，宣布他们用基因改造的手段，将人类体细胞改造成了类胚胎干细胞，在功能上几乎可以和胚胎干细胞相媲美。,诱导产生多能性干细胞：,几个转录因子导入已分化的细胞，

16、进而获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称之为“诱导产生的多功能性干细胞”（induced pluripotent stem cells,iPS细胞）。,方法：,借助“逆转录酶病毒”为载体,即向皮肤细胞中植入一组4个基因 (Oct4,Sox2,c-myc和Klf4 )，通过基因重新编排，使皮肤细胞具备胚胎干细胞的功能。这种被改造过的细胞称作“iPS细胞”。,优越性：,1、利用iPS细胞作为实验模型，只操纵几个因子的表达，加速对多能性调控机理的深入研究。 2、获得的方法相对简单稳定，不涉及胚胎的破坏，无伦理道德限制。 3、对于疾病机理研究和新药开发等方面将有很大贡献。 4、可望制造特定病人来源

17、的iPS细胞，用“个性化”移植来治疗诸多疾病。,iPS细胞检测-hES 标记表現,stage-specific embryonic antigen-1(SSEA-1),Ips细胞研究中存在的问题,1、肿瘤相关基因，如c-myc的使用，有诱发癌症的可能。 2、逆转录病毒转染可能会导致一些癌基因的激活，也可能导致某些重要基因功能受阻。 3、基因表达模式与ESC还存在一些不同。 4、效率较低，重组率只有0.1%。,iPS细胞形成畸胎瘤,In vivo：将iPS细胞胞注射至严重免疫缺陷综合症(SCID)小鼠的背側皮下。 九周后：产生肿瘤 组织学检测：肿瘤中含有各式各样的组织 Teratoma：畸胎瘤包

18、含有器官或是组织的肿瘤，类似三個胚层的衍生物。,iPS细胞形成畸胎瘤,IPS细胞插入基因检测,PCR显示每个中都有插入四个逆转录病毒,IPS细胞非污染的产物,免疫印迹分析，以c-Myc cDNA为探針,IPS细胞与hES细胞的DNA分析结果显示两者之间仍有差异存在 效率不高：1/5103 cells 挑选出的细胞群落参杂有HDF 反转录病毒随机插入而抑制相关基因 一些没有被核型分析检测到的基因改变 反转录病毒随机插入可能会诱发癌症,1.3 造血干细胞,造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。 在20世纪五十年代，临床上就开始应用骨髓移植（BMT）方法来治疗血液

19、系统疾病。,1.4 神经干细胞,神经干细胞的研究仍处于初级阶段 理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱。,干细胞有几个主要特征,干细胞本身不是终末分化细胞； 干细胞能无限增殖分裂； 干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止 状态； 干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运保持为干细胞或分化为特定细胞。,2.干细胞应用的基础调控,干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增值和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 内源性调控 外源性调控,2.1 内源性调控,干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化 （1）细胞内蛋白对干细胞分裂的调控 在果蝇卵

20、巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。,2.1 内源性调控,（2）转录因子的调控 在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4是必需的。Oct4是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团 白血病抑制因子（LIF） Tcf/Lef转录因子,2.2 外源性调控,干细胞

21、的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响 （1）分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活.有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGF家族和Wnt信号通路。,2.2 外源性调控,干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响 （2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。-Catenin就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响.,2.2 外源性调控,干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响 （3）整合素

22、（Integrin）与细胞外基质 整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。 1整合素,2.3 干细胞的可塑性,通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律。 1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。这种现象被称为干细胞的横向分化,干细胞的研究与应用,基础研究 药物开发 器官移植,基础研究,在基础研究方面，多功能干细胞的研究能帮助人类了解，

23、从一个受精卵细胞到发展成一个婴儿如此复杂的过程中所发生的事件，最主要的工作在于找到细胞发展过程中的决定因子。,药物研究,药物开发过程中，药物安全性的分析，亦可由特定干细胞或由干细胞分化的专一细胞作为试验的标的，而非传统上必须进行耗时费力又昂贵的动物实验。,器官移植,干细胞有可能产生新的细胞、组织或是器官。我们需要器官移植，但是器官的短缺限制了移植手术而产生了很多不幸。多功能干细胞经过刺激以后，可以发展成特定的细胞。对于很多疾病来说，它都是一个新的治疗方式。,3.干细胞应用平台技术,3.1 技术原理 干细胞充当了分化细胞预备队的角色。 干细胞有以下特点： （1）干细胞本身不是处于分化途径的终端。

24、 （2）干细胞能无限的增殖分裂。 （3）干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。 （4）干细胞通过两种方式生长 ，一种是对称分裂形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。,3.2 技术方向,凡需要不断产生新的分化细胞以及分化细胞本身不能再分裂的细胞或组织都要通过干细胞所产生的具有分化能力的细胞来维持机体细胞的数量，可以这样说，生命体是通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及保证持续生长。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等各种生物技术的快速发展，按照

25、一定的目的，在体外人工分离、培养干细胞已成为可能，利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，这将成为干细胞应用的主要方向。,3.3 技术突破,最近干细胞的研究有两个重大的技术突破，一是人类胚胎干细胞在体外培养成功。 1998年Wisconsin大学的James Thomson和Johns Hopkins大学的John Gearhart从人囊胚的内层细胞团中取得胚胎干细胞。他们把胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行了共培养。结果表明胚胎干细胞可以进行长达5个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋养层组织及三种胚层组织的能力。这为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础。 另外一个重大突破是成体干细

26、胞的横向分化。 1999年Goodell等人用肌肉来源的干细胞在小鼠体内分化成各种血细胞。这表明成体干细胞在一定的微环境的作用下，可以横向分化为需要的细胞和组织，从而起到极其有效的治疗作用。,3.4 干细胞的分离与纯化,干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为CD34+和Thylo而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性 另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标志

27、，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。,3.5 干细胞的体外培养,Brustle等人在体外成功地培养了鼠的ES细胞。他们首先把分离的ES细胞在含有FGF2的培养基中培养，随后加入上皮生长因子（EGF），最后在FGF2和PDGF的混合培养基中生长增殖。在这种培养条件下，ES细胞可以保持其分化潜能，如停止供给生长因子，ES细胞会分化为寡树突细胞或星状细胞,4.干细胞技术的市场前景,研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依

28、赖型糖尿病等。,4.1 优点明显,低毒性（或无毒性），一次药有效； 不需要完全了解疾病发病的确切机理； 还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。 用干细胞治疗疾病已不再只是设想。,4.2 革命性的机制转变,利用胚胎干细胞治疗疾病有广泛的应用前景，但是干细胞应用在欧美却受到社会伦理学的制约，并且在实际应用中还不能避免免疫排斥。因此横向分化的发现在干细胞研究中具有革命性意义。它打破了用于临床治疗的干细胞只能来源于胚胎或受精卵的限制，为干细胞治疗疾病提供了新途径。人们可望从自体中分离出成体干细胞，在体外定向诱导分化为靶组织细胞并保持增殖能力，将这些细胞回输入体内，从而达到长期治疗的目的。,4.3 体外制造人体器官,比如通过形成嵌合体，在严格的控制下，使动物的某些器官来源于人体干细胞。这些来自