流式细胞术及其应用.ppt

1、流式细胞术及其应用,第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍,概念,流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。,流式细胞仪特点,单细胞悬液或生物颗粒,分析速度高,多参数,精度高,当代最先进的细胞定量分析技术,FACSCalibur,特点： 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配

2、备1-2根激光 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析,临床型（台式机）,BD LSR,FACS Vantage DiVa,科研型（大型机）,特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选,FACSAria,科研型,特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析,流式细胞仪检测范围,细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量,细胞结构,特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性 激素结合位点 细胞受体,细胞功能,临床研究,淋巴细胞亚群测定、血小板分析

3、、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度,基础研究,淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究,流式细胞仪的工作原理,光学系统 激光光源 光收集系统 液流系统 流动室 液流驱动系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统,激光光源,单波长、高强度、高

4、稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光 最多检测13个荧光参数,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,细胞分选系统,信号检测-散色光,FSC（小角散射)光它反应细胞的相对大小和截面积的大小 SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化,全血细胞流式FSC-SSC图,它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分,信号检测-荧光信号,数据显示类型,单参数直方图（Histogram）,X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系 Y轴：

5、代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率,二维等高图和密度图,便于数据统计 不同的细胞群可以用不同的颜色标记 主要表达方式,光谱交叉,两色以上荧光分析存在 光谱交叉,荧光补偿方法,所有补偿调为“0” 调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角” 依单阳群体调节荧光补偿,抗体使用原则,根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC 使用双标以上抗体必做荧光补偿,样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋,单细胞 悬液,标记 荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,流式细胞术操作流程,统计学 分析,继续 培养,第 二 部 分 流式细胞术在不

6、同领域的应用,细 胞 周 期 分 析,样品制备,1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞,PBS漂洗 两次,70%酒精 4度固定过夜,收集固定的细胞,PBS漂洗,0.5 PBS 悬浮细胞,2.5l 10g/l RNase A,37度消化1小时,过300目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton)，,1000rpm 5分钟 离心,两次,混匀，室温 静止5分钟,上机,建立获取模式，获取数据 （PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）,去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用,数据分析,圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡,圈门去除粘连体，分析细胞周期,细胞凋亡分析,Annexin V-PE/7-AAD双染色法,双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞 双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞,人外周血淋巴细胞亚群检测,结束语,流式细胞术是一种应用范