DNA重组的机理---精华版.ppt

1、第六章 DNA 重组的机理,基因重组的相关概念 同源重组 转座重组 位点特异性重组 DNA重组技术简介,一、基因重组,英文名称：gene recombination 定义：是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换、插入等的重新组合，形成新的DNA分子的过程。包括发生在生物体内(如减数分裂中异源双链的核酸交换)和在体外环境中用人工手段使不同来源DNA重新组合的过程。,基因重组和基因突变的区别,基因重组是指非等位基因间的重新组合。能产生大量的变异类型，但只产生新的基因型，不产生新的基因。基因重组的细胞学基础是性原细胞的减数分裂第一次分裂，同源染色体彼此分裂的时候，非同源染色体之间的

2、自由组合和同源染色体的染色单体之间的交叉互换。,基因突变是指基因的分子结构的改变，即基因中的脱氧核苷酸的排列顺序发生了改变，从而导致遗传信息的改变。 基因突变的频率很低，但能产生新的基因，对生物的进化有重要意义。 原因是DNA在复制时因受内部因素(自发突变)和外界因素（诱发突变）的干扰而发生差错。典型实例是镰刀形细胞贫血症。 基因突变是诱变育种的理论基础。,基因重组的意义,重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化，没有重组也就没有现代的分子克隆技术，是基因变化、物种演变、进化的基础。,基因重组的类型,1、同源重组 2、转座重组 3、位点特异性重组 4、拷贝选择,重组的类型,二、同源重组,同

3、源重组是指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。 细菌的接合、转导、转化和真核细胞的同源染色体之间的交换等都属于同源重组。,1.真核生物的同源重组模型,Holliday model 相互侵入（交换）模型 Meselson-Radding model 单链侵入模型 Double-strand breaks initiate recombination 双链断裂重组模型,同源重组的Ho

4、lliday模型,由Robin Holliday在1964年首先提出，后由David Dressler和Huntington Potter 在1976年提出修改，他们证明了Holliday中间物的存在。,Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤,两个同源染色体DNA排列整齐 一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体 通过分支移动产生异源双链DNA Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA 片段重组体patch recombinant 拼接重组体splice recombinant,片段重组体：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组

5、体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。 拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,电镜下的Holliday结构,Meselson-Radding单链侵入模型,Holliday模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不均等分离现象，1975年Meselson-Radding 提出模型解释这种不对称重组现象。,Double-strand breaks initiate recombination(双链断裂重组模型),有一些例外的重组现象，最典型的例子为基因转换(gene conversion)。 基因转换首先在酵母及真菌中被发现，现已证实在许多生物中存

6、在。 一种等位基因形式转变为另一种等位基因形式，只发生在减数分裂时期。,异常分离与基因转变,在一个杂合体中，如果一染色体把基因A交给它的同源染色体，则它的同源染色体必定把基因a交回给它，所以在真菌中，一个座位上的两等位基因分离时，应该呈现2：2或1：1：1：1或1：2：1的分离(表8-1)，这就说明重组通常总是交互的。可是Lindegren在面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）中发现，有的子囊含有（3A+1a）或（1A+3a）的子囊孢子。以后在脉孢霉、酿酒酵母、子囊菌Ascobolus immersus及果蝇中也发现这种现象。,同源重组机制的应用: 基因敲除小鼠,2、原

7、核生物的同源重组,细菌同源重组的特点：细菌的接合、转化以及转导重组都是同源重组，而且这种重组是发生在一个完整的环状双螺旋DNA分子与一个双链或单链DNA分子片段之间的。且重组需要3种基因所编码的RecA和RecBCD蛋白质。,A、接合（conjugation）,通过性菌毛连接沟通，将遗传物质（质粒或染色体DNA)从供体菌转移给受体菌的过程。 接合性质粒：F质粒、R质粒、Col质粒、Vi质粒 等,质粒：细菌染色体外的小型环状DNA分子,B、转化（transformation）,概念：受体菌直接摄取供体菌裂解后游离的DNA片段而获得新性状。 转化因子：在转化过程中转化的DNA片段。,如：溶菌时，裂

8、解的DNA片段被另一细菌摄取,C、转导（Transduction）,以温和噬菌体为载体，将供菌体的一段DNA转移到受体菌体内，使受体菌获得新的性状。,噬菌体生活史：溶菌生长途径 溶源菌生长途径,三、转座重组,转座重组是指DNA上的核苷酸序列从一个位置转位或跳跃到另外一个位置的现象，在原核生物和真核生物的基因组内均可以发生，发生转位或跳跃的核苷酸序列被称为转座子或可移位的遗传元件。,1、转座重组的特点 2、转座子与反转座子 3、转座机制,主要内容：,1、转座重组的特点： 与同源重组和位点特异性重组不同的是：转座子的靶点与转座子并不存在序列的同源性。接受转座子的靶位点可能是随机的，也可能具有一定的

9、倾向性（如存在热点或一致序列），这与转座子本身的性质有关。,不必借助同源序列就可以移动DNA片段，即转座作用与供体和受体之间的序列无关； 原核生物和真核生物均可发生转座重组； 转座序列可在染色体上移动甚至可以在不同染色体间跳跃。,2、转座子,转座子(Transposon)又称跳跃因子,是指可以在生物的染色体组中从染色体的一个位点“跳”到另一个位点,或从一条染色体转移到另一条染色体上的一定长度的DNA片段 。 分为：原核生物转座子 真核生物转座子,原核生物转座子,简单转座子（插入序列） 复杂型转座子 复合型转座子 噬菌体,插入序列（IS） 较小，长度一般在700bp1800 bp之间； 绝大多数

10、两端含有10bp40 bp长的反向重复序列； 通常内部只有一个基因，编码的蛋白质是专门催化转位反应的转座酶（tnpA），没有任何抗生素或其它毒性抗性基因；,通过“剪切”和“粘贴”的方式进行转座，转座结束后可导致插入点序列重复； 有少数IS，没有明显的反向重复序列，它们是通过复制（滚环复制）与粘贴的方式进行转座的。,复杂型转座子,长度较长； 两侧含有较长的反向重复序列； 内部含有一个或几个结构基因，常见的结构基因有：转座酶基因tnpA，解离酶基因tnpR和抗生素抗性基因； 转座完成以后可导致约5 bp长的靶位点序列加倍，从而在转座子两侧产生直接重复序列。,复合性转座子,由2个插入序列和一段带有抗

11、生素抗性或其它毒性抗性的间插序列组合而成，其中的2个插入序列位于转座子的两侧，相互间的方向可能相反，也可能一致。每一个插入序列具有典型的第一类转座子的特征，带有转座酶，它可能独立地转位，也可能与间插序列一起作为一个整体进行集体转移。,Mu噬菌体,Mu噬菌体是大肠杆菌的一种温和性噬菌体，其DNA为线性双链，长度约为38 Kb，两侧无反向重复序列，基因组有20多个基因，但只有A基因（编码转座酶）和B基因（与复制和转座有关）与转座有关联。 在转座的过程中，可引起靶位点序列重复。在溶源状态下，它能在宿主DNA的不同位置间随机转移。,真核生物的转座子,Barbara McClintock,Nobel P

12、rize for Physiology Medicine 1983,玉米的Ac-Ds系统,真核生物的转座子根据其DNA结构和转座机理的不同,分为两类,第一类是反转座子，其转座过程是DNARNADNA，需要RNA中间体；第二类是DNA转座子，其转座过程是DNADNA，无RNA中间体。,睡美人转座子的结构,A转座子,B转座子,反转座子,反转座子在真核生物的基因组中占很高的比例，它在结构、性质和转位的方式上与逆转录病毒的复制很相似。首先是DNA被转录为RNA中间物，然后RNA中间物被逆转录成双链DNA，最后，双链DNA在新的位点上整合到基因组DNA上。,反转座子的结构,3、转座的机制,“剪切”和“粘

13、贴”机制 “复制”和“粘贴”机制,由DDE转座酶介导的转座子“剪切”和“粘贴”机制,由Y-转座酶或S-转座酶介导的转座子“剪切”和“粘贴”机制,转座子的“复制”和“粘贴”机制,反转座子的转座机制,四、位点特异性重组,1、定义 位点特异性重组是指在DNA特定位点上发生的重组，它需要专门的蛋白质识别发生重组的特异性位点，并催化重组反应。,如果发生在2个DNA分子之间，通常会导致2个DNA分子之间发生整合； 如果是发生在1个DNA分子之内，则可能发生缺失或倒位。,位点特异性重组可以发生在2个DNA分子之间，也可以在1个DNA分子之内。,缺失和倒位式位点特异性重组图解,2、位点特异性重组的功能,（1）

14、调节噬菌体的整合； （2）调节基因表达； （3）调节胚胎发育期间程序性的DNA重排。,3、位点特异性重组的步骤,链交换 形成Holliday中间体 分支迁移 分离,噬菌体的整合 鼠沙门氏细菌鞭毛相的转变 免疫球蛋白基因重排过程,4、位点特异性重组实例,A、 噬菌体的位点特异性整合,大肠杆菌染色体：整合位点attB，该区域通常被称为BOB。 噬菌体：重组位点称为attP，其中央也含有与attB一样的15 bp保守序列，以POP表示。 整合：自身编码的蛋白质整合酶（Int）、 宿主蛋白整合宿主因子（IHF）。,酪氨酸重组酶与重组DNA的结合模型,噬菌体重组整合或切除时切点的序列,噬菌体的位点特异性

15、整合,噬菌体的对E.coli的整合： POP + BOB BOP+POB,B、鼠沙门氏菌鞭毛抗原的转换,H片段,C、免疫球蛋白基因重排过程,V片段 J片段,五、重组DNA技术简介,应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子。,重组DNA操作一般步骤：,分：分离目的基因 接：目的基因与载体连接 转：重组DNA转入受体菌 筛：筛选出合适的受菌体,1、分：分离目的基因,目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(target DNA)。 类型：cDNA(complementary DNA) 基因组DNA(genetic DNA),获得需要的目的基因常用的方法：,（1）总DNA：直接从生物体中提取，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； （2）mRNA：以其为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； （3）PCR：利用聚合酶链式反应，特异性地扩增所需要的目的基因片段； （4）化学合成,2、接：目的基因与载体连接,载体：运送目的基因片段进入宿主细胞的工具。 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母人工