食品微生物检验讲义

1、2,2010年颁布的十项标准,1 食品微生物学检验 总则 2 食品微生物学检验 菌落总数测定 3 食品微生物学检验 大肠菌群计数 4 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 5 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 6 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数 7 食品微生物学检验 乳与乳制品检验 8 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 9 食品微生物学检验 乳酸菌检验 10食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验,已于2010年6月1日实施,2010年颁布的十项标准,已于2010年6月1日实施,GB 4789.1 2010 GB 4789.2 2010 GB 4789.3 2010 GB 4789.4 2

2、010 GB 4789.102010 GB 4789.152010 GB 4789.182010 GB 4789.302010 GB 4789.352010 GB 4789.402010,3,食品微生物学检验 GB 2010 修改内容,一、菌落总数测定 删除了PetrifilmTM测试片法 在“培养基和试剂”中增加了无菌生理盐水的配制方法 二、大肠菌群计数 删除了PetrifilmTM测试片法 “第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU150 CFU” 三、沙门氏菌检验 删除了科玛嘉、API和VITEK等商品名 个别培养基配方有变化HE琼脂、三糖铁琼脂,4,食品微生

3、物学检验 GB 2010 修改内容,四、金黄色葡萄球菌检验 个别培养基配方有变化7.5%氯化钠肉汤 五、霉菌和酵母计数 删除了高盐察氏培养基，保留孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂 孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂的配方有所调整 六、单核细胞增生李斯特氏菌检验 删除了VIDAS和BAX两种快速检测方法 新增含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤和含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂 显色培养基删除了商品名“科玛嘉”,5,食品微生物学检验 GB 2010 修改内容,七、乳酸菌检验 修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。,八、阪崎肠杆菌检验 显色培养基不再专门指定使用DFI,6,食品微生物

4、学检验 GB 2010 修改内容,1、新增品种 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂 P-109莫匹罗星锂盐 2、改变配方的品种 HE琼脂 三糖铁琼脂 7.5%氯化钠肉汤 孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂 3、删除了科玛嘉、API、VITEK等商品名 4、删除了Petrifilm测试片法 5、删除了VIDAS、BAX等快速检测方法,GB 2010 修改内容 小结,7,食品微生物学检验 总则,1 检验人员 2 仪器设备 3 检验培养基、试剂 4 采样 5 样品的接受和预处理 6 检验质量 7 参考菌株和及其保存,GB 4789.1-2010,食品微生物检验的质量控

5、制,8,食品微生物学检验 总则,岗前培训、继续教育、参加水平测试和盲样测试、定期考核,GB 4789.1-2010,1 检验人员,9,食品微生物学检验 总则,高压灭菌锅 灭菌物品不宜过多 压力降至零再开锅 干热灭菌锅 器皿和内层底板不能直接接触压力降至零再 开锅 装有纸包装的物品灭菌温度不能超过160 培养箱 每天记录温度和湿度 随手关门维持恒温 培养物不宜与培养箱最底层直接接触,GB 4789.1-2010,2 仪器设备,显微镜 注意防尘、清洁 使用油镜后擦拭 其他 不同物品采用正确的灭菌方式 已灭菌和为未灭菌用品应分开，且有明显标识,10,食品微生物学检验 总则,培养基的制备和质量控制按照

6、GB/T 4789.28执行 培养基必须由专业厂家、质量必须符合有关质量标准 干粉培养基防止潮解、结块,GB 4789.1-2010,3 培养基和试剂,培养基配置注意要点 培养基配制过程主要为配制、溶解、矫正PH值、过滤澄清、分装及高压 培养基的配制必须在玻璃容器、搪瓷缸中进行，不能用铜铁器皿 分装培养基一般不超过容器的2/3；分装为试管容量1/5，斜面长度约为试管的2/3； 新制成的平皿放置在37待平板表面干燥后再使用；,11,食品微生物学检验 总则,冷冻食品应保持在冷冻状态直到检验；化冻时必须小心放置于细菌生长温度之下以免细菌数量增加 冷藏样品应尽快放在冷藏温度下解冻，亦可放在适宜温度下（

7、37）下短时间（15min）使其解冻；,GB 4789.1-2010,4 采样,5 样品的接受和预处理,所用接触样品的用具经过灭菌 取样要均匀、特殊样品要控制温度,12,食品微生物学检验 总则,GB 4789.1-2010,6 检验质量,定量检验时一般固态样品宜用重量法，液体样品宜用体积法；对于黏性液体（如酸奶）如用体积会粘附一定量的样品在吸管上，此类样品最好用重量法 如检样需用无菌生理盐水稀释，最好用均质器 8000-10000 r/min转速1min，制成均匀悬液； 微生物培养选择正确的培养温度和时间,13,食品微生物学检验 总则,GB 4789.1-2010,7 参考菌株,实验室要做好参

8、考菌株的登记、验证记录、传代记录、销毁记录 菌株由专人保管，做好菌株的进出登记,14,食品微生物学检验 总则,对于微生物检验报告对照各类标准对食品卫生的微生物学质量进行全面准确的评价并作出合理的解释 编制微生物学检验报告考虑引入不确定度概念；,GB 4789.1-2010,8 检验结果及结果的质量控制,微生物测试的主要影响因素 取样 样品量 样品种类 目标微生物在样品中的分布,样品中含有的微生物数量水平 样品稳定性 倍比稀释 读数,15,1菌落的定义： 将细菌划线接种在固体培养基上经4872小时培养，长出肉眼可见 有单一细菌生长繁殖而成的细菌集团。,一 概念,2菌落总数： 食品检样经过处理，在

9、一定条件下培养后，所得1ml（g）检样中形成 的微生物菌落的总数。,GB 4789.2-2010,食品微生物学检验 菌落总数测定,16,食品微生物学检验 菌落总数测定,GB 4789.2-2010,二.1 菌落总数的检验程序,卫生学意义： 反应了食品在加工、储存、运输过程中的污染程度。,17,食品微生物学检验 菌落总数测定,GB 4789.2-2010,二.2 菌落总数的检验程序,1 配制培养基,3 系列稀释,6 孵育,2 样品准备,4 平板接种,5倾注放置平板,8 报告,7 阅读,18,食品微生物学检验 菌落总数测定,GB 4789.2-2010,三 系列稀释,10-1,1ml,19,食品微

10、生物学检验 菌落总数测定,GB 4789.2-2010,可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。,选取菌落数在 30 CFU300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计

11、数。,四 菌落计数,20,食品微生物学检验 菌落总数测定,GB 4789.2-2010,五 菌落总数计算公式,若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算。,式中： N样品中菌落数； C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d稀释因子（第一稀释度）。,21,食品微生物学检验 菌落总数测定,GB 4789.2-2010,六 菌落总数的报告,菌落数小于 100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2位数字

12、，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。,22,食品微生物学检验 菌落总数测定,GB 4789.2-2010,七 菌落计数实例,23,食品微生物学检验 菌落总数测定,GB 4789.2-2010,八 注意事项,操作要在无菌的状态下进行。 操作时间越短越好。 样品不同选择的稀释倍数不同。 培养基冷却温度不宜过高或过低。,24,食品微生物学检验 大肠菌群计数,1大肠菌

13、群（ coliforms）定义： 大肠菌群系指一群在一定条件下能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 该菌主要来源于人畜粪便，故以次作为粪便指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。,GB 4789.3-2010,一 概念,2 MPN (most probable number)定义： 最大或然数计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群, 并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。 缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。 基于泊松分布的一种间接计

14、数方法。,25,食品微生物学检验 大肠菌群计数,GB 4789.3-2010,二 培养基和试剂,月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（Lauryl Sulfate Tryptose，LST） 煌绿乳糖胆盐肉汤（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA） 磷酸盐缓冲液 无菌生理盐水 无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A中 A.6。 无菌 1 mol/L HCl：见附录 A中 A.7。,26,食品微生物学检验 大肠菌群计数,GB 4789.3-2010,三 大肠菌群MPN计数法的检验程序,27,食品

15、微生物学检验 大肠菌群计数,GB 4789.3-2010,四 大肠菌群平板计数法的检验程序,28,食品微生物学检验 大肠菌群计数,GB 4789.3-2010,五 大肠菌群平板计数的报告,经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。 例：10 样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/1010 /g（mL）=6.010 CFU/g（mL）。,29,食品微生物学检验 菌落总数测定,GB 4789.2-2010,六 注意事项,LST

16、初管和BGLG复发酵管在灭菌以后要检查小导管内有无气泡,如果有气泡就不能再用了。 计算产气管的数量时以BGLG发酵管产气管的数量为准。,30,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验,1金黄色葡萄球菌： 革兰染色阳性球菌，呈圆球状，形似葡萄串状排列 需氧或兼性厌氧，在肉浸液琼脂或加入血液的培养基上生长良好 耐盐性很强 可产生金黄色色素 血琼脂上产生透明溶血环，且菌落较大 能产生血浆凝固酶,GB 4789.10-2010,一 .1概念,31,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验,2 金黄色葡萄球菌的致病物质： 血浆凝固酶 葡萄球菌溶血素 肠毒素 毒性休克综合毒素-1和SPA,GB 4789.10-2

17、010,一 .2 概念,3 金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病： 食物中毒 毒性休克综合征及假膜性肠炎,32,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验,4 易受金黄色葡萄球菌污染的食物： 火腿、肉馅及熟肉制品 鱼贝类、蛤类 乳制品及含奶的糕点：奶油蛋糕、牛角酥等 果汁 生菜沙拉,GB 4789.10-2010,一 .3概念,33,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验,GB 4789.10-2010,二 主要培养基和试剂,10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤 7.5 %氯化钠肉汤 血琼脂平板 Baird-Parker琼脂平板 脑心浸出液肉汤(BHI) 兔血浆 营养琼脂小斜面 革兰氏染色液,34,食品微生物学检验

18、 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,三金黄色葡萄球菌定性检验程序,35,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,四金黄色葡萄球菌定性鉴定要点,1 Baird-Parker平板和血平板生长的典型菌落特征 2 革兰氏染色镜检典型形态 3 血浆凝固酶实验 4 葡萄球菌肠毒素的检验,36,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,4.1 Baird-Parker平板和血平板,Baird-Parker平板 菌落直径为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。,血平板 菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润

19、、 金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。,37,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,4.2.1 革兰氏染色原理,38,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,4.2.2 金葡革兰氏染色,金黄色葡萄球菌染色镜检 革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 m1 m。,39,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,4.3 血浆凝固酶实验,原理 致病性金黄色葡萄球菌产生一种游离的凝固酶，可使人或兔血浆中的协同因子激活变为凝血酶样物质后，使液态的纤维蛋白变为固态的纤维蛋白，从而使血浆凝固

20、。,操作要点 该实验必须用大量的菌和小量的血浆进行实验，血浆用量不要多，千万不 要在血浆中做菌悬液 最好用BHI增菌液，增菌效果好 每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现 凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。 - 检查凝固形成时，不要振动试管，以免造成假阴性结果,40,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,4.4 葡萄球菌肠毒素实验,A、B、C、D、E 型金黄色葡萄球菌肠毒素分型 ELISA 检测试剂盒检测,41,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,五 结果判定与报告,结果判定 符合血平皿

21、及B-P平皿菌落特征、革兰氏染色特征和血浆凝固酶全部三项，可判定为金黄色葡萄球菌,结果报告 在 25 g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。,42,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,六 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数,适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数,43,食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌,GB 4789.10-2010,七 金黄色葡萄球菌MPN计数,适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。,44,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,1 沙门氏菌： 无芽孢革兰氏阴性杆菌 营养要求不高，对

22、胆盐耐受 耐盐性很强 大多数不发酵乳糖，不产生靛基质，不分解尿素 大多数菌株产生H2S，发酵葡萄糖产酸产气 抗原结构主要为O抗原和H抗原，及与毒力有关的Vi抗原 O抗原即菌体抗原，主要为脂多糖 H抗原即鞭毛抗原，化学成分为蛋白质，性质不稳定 Vi抗原为不耐热的酸性多糖聚合体，加热60 30min可破坏 该抗原具有抗吞噬及阻止O抗原抗体凝集作用,GB 4789.4-2010,一 .1概念,45,2 沙门氏菌的致病物质： 侵袭力:菌毛抗吞噬；Vi抗原 内毒素:机体发热、白细胞变化 微循环障碍 肠毒素:腹泻,一 .2 概念,3 沙门氏菌引起的食源性疾病： 肠热症：慢性发热症状 食物中毒：表现为恶心、

23、呕吐、腹疼、腹泻 慢性肠炎：表现为发热，粘液便 败血症：表现为高热、寒战 厌食和贫血症状,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,46,4 易受沙门氏菌污染的食物： 生家禽肉制品及熟肉制品 鱼贝类、蛤类 乳制品 水果蔬菜,一 .3概念,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,47,二 主要培养基和试剂,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,48,三.1 沙门氏菌检验程序,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,49,三.2 沙门氏菌检验程序,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,5

24、0,四 沙门氏菌鉴定要点,1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 2 生化试验 3 血清学鉴定,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,51,4.1.1 BS琼脂,BS琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色； 有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,52,4.1.2 沙门显色培养基,沙门显色培养基 紫色菌落,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,53,4.2.1生化鉴定,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,1 初步筛选

25、,54,4.2.1 生化鉴定,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,2 进一步生化,55,4.2.2 TSI培养基试验,原理 乳糖和蔗糖与葡糖糖比为10：1 酚红指示剂，酸性为黄色，碱性为红色 分解葡糖糖不分解乳糖和蔗糖，斜面为碱性，底层为酸性 分解葡糖糖且分解乳糖和蔗糖，斜面和底层均为酸性 细菌在酸性环境利用S产生黑色硫化亚铁沉淀,结果判读 斜面碱性（红色）/底层碱性（红色）：产碱性，不发酵碳水化合物； 斜面碱性（红色）/底层酸性（黄色）：发酵葡萄糖，不发酵乳糖和蔗糖 斜面碱性（红色）/底层酸性（黑色）：不发酵乳糖，产H2S 斜面酸性（黄色）/底层酸性（黄色）：发酵乳

26、糖大肠菌群特征,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,56,4.2.3 氨基酸脱羧酶试验,原理 细菌产生分解鸟氨酸（或赖氨酸、精氨酸）的氨基酸脱羧酶，生成碱性的胺 培养初期，葡糖糖发酵产生少量酸培养基变为黄色 若氨基酸脱羧，形成碱性胺，培养基又变为原来的紫色,结果判定 对照管：黄色 阳性管: 紫色 阴性管：黄色 空白管：紫色,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,57,4.2.3 氨基酸脱羧酶试验,操作及鉴定要点 接种前必须把所有管做好记号 必须做对照管（不含检定氨基酸的培养基），对照管一直为黄色，如果为阳性（紫色），试验无效不能做出判定 试验管

27、和对照管必须用无菌石蜡封口，厌氧培养，防止假阴性结果 至少培养18-24小时才能判断结果，过早判断可能造成假阴性 该试验在孵育期间静置后可呈现两种不同颜色，判定结果前要轻轻摇动试管,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,58,4.3 血清学鉴定,依据抗原抗体特异性结合，通过凝集反应来判断,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,血清学鉴定操作要点 与抗血清补凝集时，在玻璃试管内内将菌液制成菌悬液，煮沸15-30min,冷却后再做凝集试 因为Vi 抗原能阻断O凝集，而煮沸处理能破坏菌体表面的Vi 抗原,59,五 结果判定与报告,结果报告 综合生化试验

28、和血清学鉴定的结果报告 报告在 25 g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。,食品微生物学检验 沙门氏菌检验,GB 4789.4-2010,60,食品微生物学检验 霉菌和酵母计数,霉菌和酵母 真菌 酵母为单细胞真菌 霉菌为多细胞真菌，有菌丝和孢子,GB 4789.15-2010,一 .概念,61,二 主要培养基和试剂,食品微生物学检验 霉菌和酵母计数,GB 4789.15-2010,马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基 孟加拉红培养基,62,三 霉菌和酵母计数的检验程序,食品微生物学检验 霉菌和酵母计数,GB 4789.15-2010,63,食品微生物学检验 霉菌和酵母计数,GB 4789.15-201

29、0,肉眼观察，必要时用放大镜，记录稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。,选取菌落数在 10 CFU150 CFU之间。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 霉菌蔓延生长覆盖整个平板的课记录为多不可计。,四 菌落计数,64,食品微生物学检验 霉菌和酵母计数,GB 4789.15-2010,五 菌落总数的报告,菌落数小于 100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2位数字，后面用 0 代替位数；也可用10 的指数形

30、式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母。,65,食品微生物学检验 乳与乳制品检验,样品应具有代表性 采样过程采用无菌操作，采样方法和采样数量根据具体产品的特点和产品标准要求执行 样品在保存和运输过程中，采取必要的措施防止样品中原有微生物数量变化，保持样品原有状态,GB 4789.18-2010,一 .采样方案,66,食品微生物学检验 乳与乳制品检验,GB 4789.18-2010,二 .检样的处理,乳及液态乳制品的处理 无菌操作，75%酒精棉球消毒盒盖或袋口 体积稀释法，取25ml检样放入225ml灭菌生理盐水,半固态及固态乳制品的处理 重量稀释法，取25g检样放入225ml预热到45灭菌生理盐水,67,食品微生物学检验 乳与乳制品检验,GB 4789.18-2010,三 .检验方法,参照各种微生物检测标准,68,食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验,1 单增污染的食物： 肉类：冰冻分割的禽肉 蛋类 禽类 海产品