RapiGest SF表面活性剂用于溶液中酶蛋白消 我

1、RapiGest SF试剂：促进溶液中蛋白酶解的有利工具Ying Qing Yu与Martin Gilar美国马萨诸塞州米尔福德沃特世公司简介本应用纪要中，我们介绍了沃特世专利RapiGest SF试剂的物理化学性质及其应用领域。2002年，我们首次推出RapiGest SF，这一创新产品是帮助酶消解的有利工具，可促进溶液中蛋白的消解，它能够改善样品制备过程中蛋白的溶解度。RapiGest SF提高酶解速率与完全程度的机理详见图1。温和的蛋白变性可打开蛋白结构并暴露酶切位点，以供酶切。在RapiGest SF溶液中，酶对变性的耐受性优于普通蛋白，并能保持活性。在加入酶之前高温加热RapiGes

2、t SF溶液可使球蛋白更为完全变性，之后需将酶与样品一起进行37 C的孵育。1,2超过200多家行业内杂志引用了使用RapiGest SF进行样品溶解的案例，大部分为蛋白组学的应用。最近，许多制药实验室使用RapiGest SF用于蛋白药物的确证。因为酶消化的速度的提高并在LC、MS分析前极易清除，RapiGest SF已被多个应用领域广泛接受，其中包括高级序列研究的LC/UV/MS蛋白药物的肽图分析。讨论什么是RapiGest SF?RapiGest SF是酸性不稳定表面活性剂，在酸性条件下极易水解。1这种独特的性质，在需要的时候，可用于从溶液中清除表面活性剂。RapiGest SF的结构及

3、其水解副产物见图2。酸性不稳定的性质可在pH2条件下，45分钟内达到完全降解。1该表面活性剂可降解为两个产物：dodeca-2-one和3-（2,3-二羟基丙基）丙磺酸钠。前者与水不能互溶，可通过离心清除。后者在水溶液中溶解度很高，而在反相LC模式下不保留。酶消解后的水溶液可直接进行HPLC、LC/MS或MALDI-TOF MS进行分析。消解后的清除样品分析前无需额外去清除表面活性剂（如透析）。在分析前，酶消解后通常经过酸（如甲酸、三氟乙酸（TFA）或盐酸（HCl）的酸化，降解RapiGest SF。建议降解条件pH 2。胰蛋白酶消解的兼容性胰蛋白酶是最常见的蛋白水解酶，可用于肽图分析和蛋白组

4、学的应用。我们研究了在添加RapiGest SF的情况下胰蛋白酶的活性作用，并与文献中最常见的变性剂的作用做了对比。本检测基于胰蛋白酶诱导N-苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）在50 mM重碳酸胺（pH 7.9）中的室温水解。胰蛋白酶活性的变化通过UV 253 nm下测量BAEE水解率进行计算。在选择的变性溶液中，胰蛋白酶活性与对照样品进行对比（非变性剂）。结果见于表1。表1中的数据说明低浓度下（0.1%） RapiGest SF不抑制胰蛋白酶的活性。这与结构上类似的表面活性剂SDS不同，SDS是很强的变性剂，可会使胰蛋白酶失活。尿素、乙腈或盐酸胍也是胰蛋白酶消化的变性剂。但是乙腈是强洗脱

5、剂会干扰消解样品进行反相LC分析。正如我们所知，尿素可使蛋白共价修饰，盐酸胍也和SDS一样可以使酶失活。本实验说明蛋白酶的活性受到蛋白溶液中所用变性剂的影响。RapiGest SF在从低到高的浓度下均不改变酶活性，因此，最佳的蛋白消解条件是无需过量酶即可达到酶解的结果。快速蛋白消解对蛋白酶解存在抗性的蛋白使用RapiGest SF试剂，可在数分钟内消解完全。完全消解球蛋白、马肌红蛋白只需要5分钟内即可完成。该试剂辅助的消解结果与对照见图3。由于肌红蛋白是球蛋白，众所周知，若没有表面活性剂将难以消解。在对照反应中，与胰蛋白酶孵育9小时后只有少量的蛋白可以消化。使用了RapiGest SF试剂，总

6、体的消解的效率显著提升。在蛋白药物肽图中的序列覆盖范围更大RapiGest SF在蛋白组学的样品前处理中广泛使用，是有效的蛋白溶解变性剂。最近越来越多的生物制药实验室在肽图分析中采用了RapiGest SF。一些发表的论文记录了使用RapiGest SF进行蛋白药物消解的优势。4,5经报导的RapiGest SF浓度范围为0.05 -1%，取决于蛋白疏水性与浓度。我们发现浓度范围为0.05 -1%的RapiGest SF足以使各种大小的蛋白变性，高浓度RapiGest SF适合全细胞蛋白提取的实验。单抗（mAbs）肽图分析一直以来都因为难以消解这些大疏水蛋白而难以实现。肽图分析的目的是确认蛋白

7、序列并发现所有存在后翻译修饰（PTMs）的蛋白。图4举例说明了RapiGest SF辅助的人单抗消解的实例。样品制备与分析的参数以UPLC和四级杆Tof质谱分析的参数已列表作为指导。图4显示实验中总序列覆盖率为98%。数据分析通过BiopharmaLynx v.1.2软件得到。高序列覆盖率（98%）说明单抗完全消解。LC/MS分析中没有发现错误酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。剩下的2%未确认的序列为少数二个氨基酸的肽或单个氨基酸（R或K），而无法在反相柱上保留。样品制备人单抗样品（10 L, 21 mg/mL）在含有0.1% （w/v） RapiGest SF 的50 L 50 mM重碳酸铵中

8、溶解。将2 L 0.1 M的二流苏糖醇（DTT）加入样品，样品在50 C加热30分钟，加入4 L 0.1 M的碘代乙酰胺，在样品冷却至室温后样品在黑暗中静至40分钟。人化单抗IgG多肽图谱蛋白序列覆盖率= 98%样品中加入8 g胰蛋白酶（胰蛋白酶浓度= 1 g/L），样品在37 C孵育过夜。消解样品与1%甲酸与10%乙腈混合（1：1，v：v）。用Milli-Q水（Millipore）稀释至5 pmol/L后进行LC/MS分析。LC 条件LC 系统：沃特世 ACQUITY UPLC系统色谱柱：ACQUITY UPLC BEH 300 C18 肽分离专用柱, 2.1 x 100mm （P/N =

9、）柱温：40 C样品进样：2 L （10 pmol）溶液A：0.1% 甲酸水溶液溶液B：0.1% 甲酸乙腈溶液流速：200 L/min梯度：0-2分钟:2%B2 92分钟：2 -35% B92 -102分钟：35 - 50% B102.1 -105 分钟：90% B105.1-110分钟：2% BMS条件MS系统：沃特世SYNAPT MS （V型）毛细管电压：3.2 kV源温度.：120 C去溶剂温度.：350 C去溶剂气：700 L/hrMS 扫描速率：1 秒/次锁定质量通道：100 fmol/L Glu-Fib多肽（m/z 785.8426, z = 2），流速20 L/min与其他的蛋白

10、酶合用我们测试了RapiGest SF与多种蛋白酶的适配性，如Asp-N, Lys-C与Glu-C。在酶解前使用RapiGest SF变性蛋白获得了有效的消解结果。蛋白去糖基化的用途RapiGest SF也用于测试其它酶，如PNGase F，该酶用于酶切糖蛋白N-连接的糖基。2图6说明了去糖基化鸡蛋卵清蛋白。在RapiGest SF介质中PNGase F消解2小时后观察到了完全的去糖基化反应。结论nRapiGest SF促进了蛋白酶解的速度与完全程度，能够得到蛋白药物序列覆盖率很高的肽图分析。nRapiGest SF是适用于蛋白组学、糖蛋白与生物制药应用的领域n几乎无需消解后样品处理，简单样品

11、酸化，足以从溶液中去除RapiGest SF。多种情况下LC/MS分析前只需简单稀释。n RapiGest SF简化了样品制备方法，可提高分析通量；使用该方法提高实验室工作效率并提高数据质量。参考文献1. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly, mass spectrom- etry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal.Chem. 2003; 75: 6023-6028.2. Yu YQ, G

12、ilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC, A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004; 18: 711-715.3. Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometr

13、y characterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19: 2331-2336.4. Bailey MJ, Hooker AD, Adams CS, Zhang S, James DC. A platform for high- throughtput molecular characterization of recombinant monoclonal antibodies, J. Chrom. B. 2005; 826: 177-187.5. Huang HZ, Nichols A, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by Ra