感受态细胞的制备

1、(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基 在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.4.用去离子水定容至1L.(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)70冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200L移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli

2、DH5单菌落，接种于35mL LB液体培养基中，37下振荡培养过夜（12h左右）。(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种，取450L菌液转接到45mL LB液体培养基中，37振荡培养23h至OD6000.5左右。（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。） (1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。(2)在4下，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液18mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。(4)04 4000r/min离心10min，弃去上清，加入4mL预冷的0.1mol/L

3、的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）（三）感受态细胞的分装与冻存(1)在4mL制备好的感受态细胞中加入4mL 30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。(2)将此感受态细胞分装成每份200L (1.5mL dorf管)，液氮速冻，快速转入-70冰箱保存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70冰箱保存。）注意事项、细胞的生长状态和密度 最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 经过多次转接，及贮存在4的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个左右为佳。即应

4、用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为05时，细胞密度在5107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。 此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 、试剂的质量 所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4。、防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。固体LB培养基：在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.