银染方法总结

1、银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有 100 多种。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋 白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候

2、呈负染。试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序：固定：30min或者更长时间 100ml 乙醇（40% 乙醇）25ml冰醋酸（10% 冰醋酸）加水到250ml致敏：30min 75ml 乙醇（30% 乙醇）17g乙酸钠或28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250ml水洗：3 x 10min 银染：20min 0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml 水洗： 2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)显色：视情况而定 6.25 g N

3、a2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml终止：10min 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸 加水到终体积250ml 保存：1% 冰醋酸，4 注意事项：1固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。2甲醛在使用前加入。3最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。4显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。5银染液和显色液需要预冷。6所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！7清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色。银染注意事项:1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（

4、0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 S的去离子水。7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状

5、灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。12. SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用量即可避免。13. 凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍。14. 染

6、色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求。15. 银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。六 我发个简单的配方，我一直用还挺好用，固定 甲醇 250ml、冰醋酸 25ml、加双蒸水至500ml ,30min,水洗2x2min，后水洗1h。敏化 硫代硫酸钠0.1g加双蒸水至500ml,冲洗 双蒸水 2x30s银反应 硝酸银0.5g加双蒸水至500ml，避光孵育30min，冲洗双蒸水 2次x5min 显色 碳酸钠10g加双蒸水至500ml，甲醛500ul，现用现加。终止 观察至想要效果，1%的冰醋酸终止，七 银染应该注意的事项:1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0

7、.5-0.75mm）可以提高灵敏度。2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。3. 不同蛋白质对银染反应不一样，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 S的去离子水。7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕

8、色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。不要用双蒸水 用去离子的， 双蒸水 的某些离子会和agno3反应若用去离子水，也要经常给机器换滤头，以免去离子不净一 步骤 溶液 时间固定 甲醇 100ml 冰醋酸 25ml 加双蒸水至250ml 30min冲洗 双蒸水 3次敏化 甲醇75m 戊二醛（25%w/v）1.25ml 硫代硫酸钠(5%w/v) 10ml 醋酸钠（17g） 30min 加双蒸水至250ml 冲洗 双蒸水 3次银反应 硝酸银溶液(2.5%w/v) 25ml 甲醛(37%w/v) 0.1ml 加

9、双蒸水至250ml 20min冲洗 双蒸水 2次显色 碳酸钠(6.25g) 甲醛(37%w/v) 0.05ml 加双蒸水至250ml 2-5min终止 EDTA-Na22H2O(3.65g) 加双蒸水至250ml 10min冲洗 双蒸水 3次二 1）PAGE胶切下后用50乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟2）2硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒3）2硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒4）6碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗5）加中止液10乙酸中止即可三 1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml

10、0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次=20分钟；2. 50EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；3. 预处理：0.02 Na2S2O3 处理一分钟；4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；5. 染色：0.8ml 20AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟；6. 水洗：同上；7. 显色：25ml 12Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02 Na2S2O3, 漂洗1015分钟；8. 水洗：同上；9. 终止：50MeOH, 12H Ac,10分钟。四 1 银染液1（1000ml） ： 甲醇50 乙酸12 （甲醇 500ml

11、冰醋酸 120ml）2 银染液2（1000ml）： 甲醇30，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，（含乙酸 12ml） 甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸12ml3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛 0.02% （无水碳酸钠25g， 甲醛1.5ml）4 硝酸银（100ml）： 20%硝酸银 （过滤后待用）染色步骤：1 银染液1 洗2次， 每次5分钟2 银染液2 洗1次，每次30分钟3 超纯水 洗2次， 每次1分钟4 0.5%硝酸银 洗30分钟5 超纯水洗5次，每次1分钟 （关键步骤，共计5分钟）显色液显色 6 看到各条带，则倾去显色液, 1 乙酸中止我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。