免疫组织化学及其应用

1、免疫组织化学及其应用浙江大学病理学与法医学研究所周 韧1免疫组织化学的历史、现状和发展11历史 l 人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当时科学与技术发展的相应水平上的.l 医学的目的: 解除人体的病痛l 核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。l 疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、更可信、更有权威性。l 免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。病理诊断发展过程的主要事件年 代 作 者 事 件1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书1661年 Malpighi 放大镜观察后的

2、报告1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书1829年 Horner 首篇病理论文1832年 Hodgkin 报告7例尸检结果的论文1858年 Virchow 发表细胞病理学1863年 Paget 发表外科病理学1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书1914年 Mallory 发表细胞组织学原则1919年 Ewing 发表肿瘤病1924年 McFarland 发表外科病理学1926年 Karsner 发表人体病理学1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书1951年 电镜应用于病理诊断1974年 免疫组化用于病理诊断l 诊断病理学开始于19世纪l 2

3、0世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜l 20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。l 进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。12免疫组织化学的发展 121免疫学的发展 122单克隆技术的出现l 病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色”l 免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理l 从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。主要的发展过程年 代 研 究 者 事 件1941年 Coons 实用免疫荧光技术1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术1970年 Sternberge

4、r 抗体酶标记技术1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术1981年 Hsu ABC法90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法诊断免疫组化l 开始于70年代，l 发展高峰是80年代，l 90年代已在国外病理科列入病理技术室的常规工作。l 国内病理科约晚10年的进程，90年代开始在诊断病理工作中普及。2免疫组织化学的相关理论和技术 21免疫组织化学的工作原理 l 已知的特异性抗体或抗原能特异性结合l 通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金 属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色）l 借助显微镜

5、、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构抗原和抗体 抗原(antigen) 1、全抗原(complete antigen) 2、半抗原(hapten)抗体(antibody)多克隆抗体(polyclonal antibody) l 纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔）l 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。l 特异性不如单克隆抗体好，有时会造成抗体的交叉反应l 但能广泛用于石蜡包埋组织切片。原因是单克隆抗体(monoclonal antibody) l 单克隆抗体是针对一种抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。l 大多数为小鼠。其优点为特异性强、抗

6、体产量高。l 单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇，这一抗原决定簇可以是抗原分子上的无关抗原决定簇，l 在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。l 单克隆号的来源总之，任何一种免疫组织化学方法，欲获得令人满意的染色结果，除该方法本身所具有的特点（高度敏感）外，还必须选择具有高度特异和稳定的优质抗体。 （三）抗原与抗体的关系 抗原 引起机体产生免疫反应 决定免疫反应的特异性 产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质 利用抗体可以检测抗原物质 （四）抗原与抗体的反应 免疫反应 血清学反应。 1、抗原与抗体的结合是高度特异性的结合 在一定的条件下可以解离。 2、一个抗体分子有两个抗原结合点（称两价）

7、 一个抗原的分子上则可有许多个结合点（称为多价）。 3、抗原的抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制，但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持一定比例。在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。（BIGBEE现象）22免疫组织化学的应用范围及优点：221应用范围： (1)提高病理诊断准确性 (2)对疾病的预后和治疗的意义 激素 (3)癌基因蛋白的应用 (4)对肿瘤增生程度的评价 (5)微小病灶的发现 微小癌，微小病灶（如羊水栓塞） (6)在肿瘤分期上的意义 (7)指导肿瘤的治疗 (8)免疫性疾病的辅助诊断 (9)病原微生物的检测222免疫组化优点： (1

8、)特异性强 (2)敏感性高 (3)定位准确、形态与功能的结合3免疫组织化学的常用方法31标本的预处理 取材：（原则上）三对照，常用两对照（内对照） 保存：-40-80 固定 玻片处理：32抗原修复：抗原破坏的原因 抗原修复方法 A、化学方法： 胰蛋白酶 proteinase B、物理方法 单纯加热法： 高压加热法： 微波方法： （幻灯） 柠檬酸盐缓冲液 C、修复方法的评价CSA法 1:50 IgDCSA法 1:200 IgDCSA法 1:500 IgDCSA法 1:1000 IgDCSA法 1:5000 IgD33常用免疫组织化学方法： A、一步法 B、二步法 C、三步法 D、多步法 间接法

9、金银法 PAP和BigBee APAAP ABC法 EnVision法 BT法（CSA：Catalyzed signal amplification） 1:50、1:200、1:500、1:500、1:1000、1:5000、1:5000, 1:106 B、二步法 C、三步法PAPAPPAP D、多步法 E. ABC法 F. EnVisionG. CSA法（Catalyzed signal amplification） BT法CSA原理图CSA法 1:50 IgDCSA法 1:200 IgDCSA法 1:500 IgDCSA法 1:1000 IgDCSA法 1:5000 IgDH. 免疫组化在

10、细胞凋亡检测中的应用TUNEL法检测凋亡（ Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP nick-end-labling ）TdT介导的dUTP缺口末端标记TUNEL染色：直接法参照德国宝灵曼公司原位末端标记试剂盒操作手册，其主要步骤如下：（1）切片脱蜡至水，双蒸水、PBS液洗；（2）微波处理：切片置于盛有枸椽酸缓冲液（0.01M，PH6.0）的容器中微波加热.（3）PBS液洗 5min3次；（4）每张切片滴加20ugml蛋白酶K液，放于湿盒中37孵育15min；（5）切片置于0.3%H2O2-甲醇液中室温放置20-25min；（6）

11、滴加TUNEL反应混合液，37湿盒中孵育60-90min； TUNEL反应混合液主要成分：Bio-11-dUTP TdT酶（7）PBS液洗5min3次；（8）滴加链霉菌素辣根过氧化物酶液（用PBS液稀释成1:200）37湿盒中孵育30min，（9）滴加新鲜配制的DAB-H2O2液，镜下观察2-10min显色；（10）自来水充分洗涤；photoesI. 免疫组化在原位杂交中的应用3.4 重要的染色步骤的要点重要的染色步骤的要点： ABC法（卵白素生物素过氧化物酶连结法） ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后

12、与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC复合物联结形成抗原抗体生物素化二抗ABC。最后用底物显色剂显色。 步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后； (2)PBS冲洗，5min3次； (3)3%过氧化氢甲醇溶液，20min； (4)PBS冲洗，5min3次； (5)每张切片滴加非免疫动物血清20min； (6)每张切片滴加第一抗体，60min； (7)PBS冲洗，5min3次； (8)每张切片加滴加生物素化二抗，60min； (9)PBS冲洗，5min3次； (10)每张切片滴加ABC复合物，60min； (11)PBS冲洗，5min3次； (12)新鲜配制的D

13、AB溶液，310min； (13)自来水冲洗，复染，中性树胶封固。 PAP法 用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，再与PAP复合物联结，最后用底物显色剂显色。 步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后； (2)PBS冲洗，5min3次； (3)3%过氧化氢甲醇溶液，20min； (4)PBS冲洗，5min3次； (5)每张切片滴加非免疫性动物血清，20min； (6)每张切片滴加第一抗体，60min； (7)PBS冲洗，5min3次； (8)每张切片滴加第二抗体，60min； (9)PBS冲洗，5min3次； (10)每张切片滴加PAP复合物，60min； (11)PBS冲洗，5min3次； (12

14、)新鲜配制的DAB溶液，310min； (13)自来水中洗，复染，中性树胶封固。 SP法（链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连结法） 用链霉菌抗生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素蛋白即形成SP法。染色原理同ABC法。国外其他公司亦将此法注册为LSAB法，LAB-SA法和SABC法等。因SP最早建立和报道，其标记技术不断提高，以其稳定染色时间比同类方法短和价格较低而在我国逐渐普及。 步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后； (2)PBS冲洗，5min3次； (3)3%过氧化氢甲醇溶液，10min； (4)PBS冲洗，5min3次； (5)每张切片加1滴或50l非免疫性动物血清，10min； (6)每张切片加

15、1滴或50l的第一抗体，60min； (7)PBS冲洗，5min3次； (8)每张切片加1滴或50生物素标记的第二抗体，10min； (9)PBS冲洗5min3次； (10)每张切片加1滴或50l链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，10min； (11)PBS冲洗5min3次； (12)每张切片加2滴或100l新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察310min； (13)自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。35各种方法的评价 A、不同酶标记敏感性比较 B、常用免疫组织化学敏感性比较单纯间接法： 优点： 1、简单、经济 2、无BigBee现象 缺点： 1、敏感性差 2、内源性Ig干扰：二抗是一抗的

16、动物种和类特异的抗体，有可能由于内源性Ig干扰产生背景。l PAP法 优点： 1、高敏感性 2、高特异性 缺点： 1、适应性差，针对不同的种属的一 ，必须有相应的桥 和复合物。 2、内源性Ig干扰：2nd Ab接在内源性Ig上，PAP接在内源性Ig上。 3、BigBee效应：bell-shaped curvel ABC法： 优点： 1、高敏感性 2、适应性强：同样的ABC复合物可用于各种抗体的检测中 3、BigBee效应相对弱些 缺点： 内源性Ig干扰4免疫组织化学的质量控制及注意事项41Ab的保存和配制 保存性分装 即用型 配制：选最佳点42正确的设计和结果判断421阳性对照：已知的阳性对照

17、422内对照：423阴性对照： (1)用一个阴性试剂替代一抗或控制步骤 目的： 用来评价非特异性染色，并较好解释抗原部位的特异性标记。 (2)如果大规模使用抗体，一张切片的阴性区，可能就是另一张切片（不同Ab）的非特异性染色对照。 正确设计对照方法 免疫组化技术设有：l 阴性对照l 阳性对照l 抑制对照l 吸收对照l 自身对照在病理科的日常诊断工作中，只要有阴性对照和阳性对照即可。出现假阳性的几种原因 1、抗体的稀释度不正确、浓度太高。BigBee现象 2、部分多克隆抗体由于特异性等问题将出现异常表达，如S100、Lysozyme、Myoglobin等可在鳞状上皮细胞中表达。 出现假阴性的几种

18、原因 1、抗体和检则试剂盒配对是否合理。如单克隆抗体（多为鼠），其检测试剂盒应该用鼠的试剂盒，多克隆抗体（多为兔）应该用兔的试剂盒。 2、抗体的浓度太低。 3、孵育的时间太短。 4、固定和温度。 5、染色步骤是否正确。 6、染色过程中切片过分干燥。 BIGBEE图 出现背景着色的几种原因 1、内源性过氧化酶没有完全阻断。 2、正常动物血清使用不合理，如第二抗体为羊抗鼠IgG，应该用羊的正常血清。 3、脱蜡不够彻底。 4、组织粘贴剂使用不当或太浓。 5、PBS冲洗不够。 6、抗体稀释不合理，浓度太高。 7、底物显以时间太长。 显示剂的合理使用和增强方法目前最常用的显示剂l DABl AECl A

19、P-Red和Fast-Blue前两种仅能用于辣根过氧化物酶（HRP）系统的如PAP、ABC和SP后两种仅能用于碱性磷酸酶（AP）系统的如APAAP和SAP由于AEC溶于酒精，所以封片时不能用中性树胶，以免退色，而只能用甘油明胶或市售的AEC封片剂。 显示剂的增强方法主要在DAB显示时加上一些金属离子如镍、铜和钴等，现已有市售的产品，不必自己配制。44底物的选择（幻灯） DAB: 3.3-diaminobenizidine AP: Alkaline phosphatase AEC N-AS-Bi-P /NF N-AS-OL-P /FB.BB N-AS-OL-P /FB.BN N-AS-OL-P

20、/FB.RR N-AS-OL-P /FR.Violet 底物图（幻灯）（幻灯）（幻灯）（幻灯）（幻灯）（幻灯）（幻灯）结果判断标准由于影响因素很多，如不同厂家生产的同一种抗体特异性和敏感性的差异、所用的检测试剂盒特异性和敏感性的差异、技术熟练程序以及固定包埋等，其结果判断的标准化问题尚难统一。有一些原则必须掌握：l 阳性细胞定位是否明确，是胞膜、胞浆还是胞核阳性l 间质清晰，无背景着色。l 阳性细胞要在5%以上，才能定为阳性。l 参考评价： 50% +43内源性干扰：431内源性Ig： 人组织中有各种水平的内源性Ig存在，可与二抗有交叉反应。 Dako公司单用高纯化的Biotin标记的F(ab

21、)2片段，是Ra a mo IgG（重链、轻链的特异片段），这个Ab被广泛的用人正常血清吸附减法交叉反应。 由于CAS系统的高敏感性，与内源性Ig交叉反应仍可检测到，由于内源性Ig的背景染色，最好在血管、淋巴管周围、结缔组织、血管外空白阴性对照染色体识别。某些类型的上皮，如消化道上皮也可有内源性Ig（IgA）。内源性Ig的染色增加也可以是抗癌修复造成。因此，恰当的阴性对照试剂和阴性对照切片是必须的，室内源性Ig存在时，用来解释阳性结果。432内源性Biotin： 内源性结合活性Biotin可在肝小叶和肾小管上皮中存在。推荐使用Dako-Biotin-Blodcing系统（code No X05

22、90） 内源性HRP：或假HRP活性： 在血红蛋白、肌球蛋白、细胞色素、触酶中存在。还有嗜酸的细胞中，可用3% H2O2来。433内源性AP： Levamisole 可作为抑制剂434其他： HBV感染的患者的组织，及HBsAg+患者的组织，有地HRP非特异性阳性。 非免疫血清的应用：来自与二抗同系中动物的正常的非免疫血清，用于阻断步骤中，可能引起假阴性/假阳性，这是由于自身抗体。天然抗体。5 免疫组化的工作一般常规：51临床病理学常用抗体的选用 Keratin Vimentin S-100 LCA6。研究型抗体的选用原则：定义：生化特点：染色体定位：功能： 表达：在石蜡切片中的检测：B细胞类

23、抗体： CD20：定义： CD20是第一个被识别的人B细胞中位Ig分化抗原。1984年建立于第二次白细胞CD抗原分类合成。 生化特点： CD20是结构独特的糖蛋白，分子量3337kDa，它含有三个广泛的疏水区，跨膜四次，长羧基端和氨基端部分定位在胞浆内，很少一部分暴露在细胞外。染色体定位：11q12-13 功能： CD20在B细胞中有重要作用，包括细胞周期中、细胞分化中和有丝分裂诱导下的Ig分泌。四个跨膜区和细胞内磷酸化位点使人想起膜转运器或离子通道。有些证明表明CD20本身形成钙离子通道。然而也有可能CD20是离子通道融畅中一个重要的调节成分，而是运转离子本身。 表达： CD20表达限于正常

24、和肿瘤B细胞。在重链重排后，骨髓前B细胞可以表达，且在B细胞成熟各个时期均持续表达，但进入浆细胞的终末分化后失去表达。大多数B细胞肿瘤表达CD20，包括将近一半的急性淋巴细胞性白血瘤。 在石蜡切片中的检测： 抗体L26在1987年报道在石蜡切片中检测B细胞，并被广泛用于这个目的。继而又表明它与细胞内CD20的表位反应。CD79定义： 在1993年第五次白细胞专题会议上，这个B细胞受体复合物中与Ig相关的二聚体蛋白定义为CD79。生化特点： CD79二聚体，分子量约70kDa，由二个多肽链构成，二个均属Ig超家簇，一个为CD79a（mb-1或Ig-a）和另一个CD79b（B29或Ig-b）。染色

25、体定位： CD79a：19q13.2-13.3 CD79b：17q23VS38c定义：1994年Turley首先报道了这个独特的抗体。生化特点：VS38c抗体识别一个64kDa的胸内抗原。染色体定位：待查功能：没有关于VS38c抗体检测的抗原的有关信息。 表达：在所有组织中，VS38c导致浆细胞的强烈的胞浆染色，其他淋巴细胞不标记。但许多上皮细胞可标记，在某些组织中内皮细胞有弱标记。CD74功能： 在内质网中生物合成后，很快通过与MHC相连，抑制其他多肽加载到MHC-上，直到它转运到内质网。CD74也认识是直接参与类分子从内质网转运到内吞噬体的过程，它在MHC的胞吞作用中起作用。表达： CD74表达在MHC阳性的细胞上，如B细胞、单核细胞、巨噬细胞、郎罕氏细胞、树突细胞，活化T细胞的各个亚群，胸腺上皮。在细胞素（如g-IF）刺激下，CD74和MHC表达增强，在炎症中内皮和上皮细胞共表达这二个分子。CD74亦在组织中的标记的分布与MHC极其类似，与它们共同被调节有关。CD8图功能： 与CD45其他形式一样，CD45RO胞内部分有磷酸酶活性，其主要作用是关闭象CD3这样的脱磷酸化分子引起的T细胞反应。在静息T细胞活化期间，一个异构体从CD45RA转换为CD45RO。这提示CD45RA和CD45RO分别是处女型T细胞和记忆型T