植物细胞工程

1、植物细胞工程实验报告（1-3）植物愈伤组织的诱导、再分化及细胞的悬浮培养柳蕾（云南大学生命科学学院，生命科学与技术基地班，）摘要：原理和目的：根据植物细胞的全能性理论，通过脱分化、再分化等过程，通过胡萝卜愈伤组织的诱导学会通过培养基成分调控无菌操作诱导植物愈伤组织的基本技术方法，通过实验进一步深入领会植物细胞分化、脱分化、再分化的概念和过程，学习外植体的清洗、消毒、剪切和接种，无菌操作间、实验台等的消毒以及无菌操作技术等；根据胡萝卜愈伤组织经过多次继代，在细胞分裂，细胞形态和分化方面会产生各种变化，合理调节培养基中激素的种类和浓度配比，可以诱导疏松性愈伤组织的产生。利用愈伤组织获得单细胞或者小

2、细胞团块，可以建议细胞悬浮（大量）培养的初代培养体系，并在此基础之上进行培养物的继代和保持，进行有用次生代谢物的生产的原理，学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法和相关操作，通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培养技术生产有用次生代谢物这一个技术的主要流程，技术体系和注意事项，学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和方法。 关键词：愈伤组织的诱导；再分化；继代培养；悬浮培养；胡萝卜素的提取0 引言植物组织培养技术是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体,在人工配制的环境里培养成完整的植株。 植物组织培养的依据是植物细胞“ 全能性”及植物的“再生作用

3、”。 1902年,德国著名植物学家G. Haberlanclt 根据细胞学理论,大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直到单个细胞,进行悬浮培养，再提取代谢物的过程，即植物体细胞在适当的条件下,具有不断分裂和繁殖,发育成完整植株的潜力的观点。 1943年,美国人White在烟草愈伤组织培养中,偶然发现形成一个芽,证实了G. Haberlanclt 的论点.。自G. Haberlandt 提出的细胞全能性理论以来,在许多科学家的努力下,植物组织培养技术得到了迅速发展,其理论和方法逐渐趋于完善和成熟,并广泛应用于农业、林业、园艺、医药等行业,产生了巨大的经济效益和社会效益。1 材料与方法1

4、.1 植物愈伤组织的诱导1.1.1 实验仪器与用品无菌培养皿、无菌吸水纸（用饭盒包装灭菌）、镊子、解剖刀、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、灭菌器1.1.2 实验培养基配方MS+2,4-D （1mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂1.1.3 实验试剂0.1%的HgCl2液，10%的次氯酸钠液，75%酒精，无菌水1.1.4 实验材料胡萝卜根，至少长20cm，直径3cm1.1.5 实验方法1.1.5.1 培养基的配制： MS+2,4-D （1mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂）大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素1.1.5.1.1 从母液中

5、取出（移液管）所需的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分，注意计算清楚各种物质在所须配制总体积下的加入量，将其放入小烧杯中；1.1.5.1.2 在洁净的搪瓷缸里加入一定量的水（3/4）及所需要的琼脂，加热并不时搅拌，注意防止琼脂沉底焦糊；1.1.5.1.3 待琼脂溶解（呈透明状，即无固体条状或丝状物，均匀而透亮）后，加入（1）中所取的各种母液及糖，并不断搅动使其混合均匀；1.1.5.1.4 用1N HCl or NaOH 调整PH值到所须值（一般为5.8）；1.1.5.1.5 加水至所须刻度；1.1.5.1.6 趁热将培养基分装到培养用的容器（三角瓶等）中，注意不要把培养基黏附到瓶口或瓶口附近的

6、内壁上，以免今后引起污染；1.1.5.1.7 将分装好培养基的容器盖上盖子；1.1.5.1.8 高压灭菌后取出，放于室温中冷却备用；1.1.5.1.9 培养基及无菌用品的灭菌，121，30min。1.1.5.2 外植体材料消毒：取68cm长的胡萝卜一段进行以下操作：1.1.5.2.1 清洗：（流水冲洗）以下各步在超净台上进行；1.1.5.2.2 将材料转入无菌烧杯或罐头瓶，加入75%酒精浸泡12min；1.1.5.2.3 倒去酒精用0.1%升汞或10%的次氯酸钠液浸泡1015min，不断搅拌；1.1.5.2.4 倒去消毒液用无菌水洗涤35次；1.1.5.2.5 转至吸水纸上，吸取多余水分（同一

7、吸水纸部位不要重复使用）；1.1.5.2.6 用解剖刀切去两端各0.51cm部分，将中断切成0.7cm厚的薄圆片；1.1.5.2.7 将圆片移至无菌的部分，用刀切去外皮和中柱部分，将形成层切成1cm2的小片(图8)。1.1.5.3 接种：左手拿装有培养基的罐头瓶，接近酒精灯，用右手揭去盖，将瓶外部在灯焰上燎数秒钟，并旋转使充分灼烧灭菌，右手用镊子夹取材料小片送入瓶内，平放于培养基表面，轻按一下，使其紧密接触培养基。每瓶3块，均匀分布，封好瓶口。1.1.5.4 培养：放入25温箱中暗下培养一个月。1.2 植物愈伤组织的再分化诱导1.2.1 实验仪器与用品无菌培养皿、无菌吸水纸（用饭盒包装灭菌）、

8、镊子、解剖刀、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、灭菌器1.2.2 实验培养基配方MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.2mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂1.2.3 实验材料愈伤组织诱导的培养材料1.2.4 实验方法1.2.4.1 培养基的配制： MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.2mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂）大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素（配制方法与愈伤组织的诱导相同，只是有些激素或物质的量不同）1.2.4.2 接种建立起来的无菌培养物无菌条件下切割分开接种在分化培养基上适当条件下（25温箱中光照下）培养1-3周培养反应的观察1.3 植物细胞

9、的悬浮培养以及胡萝卜素的分离提取和含量测定1.3.1 实验仪器与用品无菌培养皿、无菌吸水纸（用饭盒包装灭菌）、镊子、解剖刀、超净工作台、恒温培养箱、光照、三角锥形瓶、天平、纱布/滤纸、冷凝管、蒸馏瓶、分液漏斗、表面皿、分光光度计、比色皿、移液器、移液器1.3.2 实验培养基配方继代培养：MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖,0.9%琼脂 悬浮培养：MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖1.3.3 实验试剂10% KOH的甲醇溶液、乙醚、己烷1.3.4 实验材料愈伤组织诱导的培养材料1.3.5 实验方法（悬浮培养体系的建立

10、：外植体 愈伤诱导 愈伤继代 单细胞或细胞细胞团块的获得 液体培养）1.3.5.1 培养基的配置（1）植物愈伤组织的继代培养：MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖，0.9%琼脂（2）悬浮培养的培养基：MS+2,4-D （0.5mg/L）+KT（ 0.5mg/L）， 3%蔗糖1.3.5.2 植物愈伤组织的继代培养将愈伤组织诱导的培养材料转移到新的培养基中，适当条件下培养，产生疏松性愈伤组织用于细胞的悬浮培养1.3.5.3 植物细胞的悬浮培养1.3.5.4 胡萝卜素的分离提取和含量测定1.3.5.4.1 悬浮细胞的收集1.3.5.4.2 甲醇萃取 -胡萝卜素（

11、若细胞净重大于1.2g，则加入15ml甲醇；若小于1.2g，则加入10ml甲醇）1.3.5.4.3 乙醚纯化（若细胞净重大于1.2g，则加入150ml乙醚；若小于1.2g，则加入100ml乙醚）1.3.5.4.4 含量的测定在波长452nm下测定吸光值A452。2 实验结论2.1 植物愈伤组织的诱导本实验一共做了两次（1） 第一次做时，共接种9瓶，共2瓶水侵化，2瓶霉菌污染，1瓶细菌污染，1瓶褐变，两瓶中的两块未受污染，一块既不生长，也不死亡，也无愈伤组织的形成，另一块长出很少的愈伤组织，其余块都被细菌污染。成活率=2/8=25%污染率=3/8=37.5%1）水侵化的现象为：玻璃化现象是指在培

12、养过程中材料呈半透明状,组织结构发育畸形（图1）；2）霉菌污染的现象为：在组织块表面长满了各种颜色的菌丝，且组织块已经不能正常生长（图2）；3）细菌污染的现象为：培养材料附近出现粘液状和发酵泡沫状物体,或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹（图3）；4）褐变的现象为：外植体组织出现变黑，变棕褐色的现象（图4）；5）长出愈伤组织的现象为：在外植体周围长出白色或淡黄色晶体（图5）。（2） 第二次做时，共接种6瓶，1瓶被霉菌污染，2瓶水侵化，1瓶细菌污染，2瓶无污染（污染的情况和愈伤组织情况见上五个图）存活率=2/6=33.3% 污染率=2/6=33.33% 2.2 植物愈伤组织的再分化诱导第一

13、周观察接种的两瓶未出现污染，长势良好。 预期结果：在三周四周甚至再过一个多月，未污染的培养基应该在组织的表面长出小苗，在经过一段时间的培养，应该会长出植株然后可移植到自然环境中进行栽培。2.3 植物细胞的悬浮培养以及胡萝卜素的分离提取和含量测定（1）继代培养本小组两人共接种五瓶，四瓶被细菌污染，一瓶长出疏松型愈伤组织以下各图为被污染的情况（与愈伤组织污染现象基本相似）和完好的情况（疏松型愈伤组织可与愈伤组织诱导形成的致密型愈伤组织形成对比）（2）悬浮培养本组八人培养的悬浮细胞未被污染，且长势良好，培养基清亮不混浊，但培养基和细胞的总重量相对于之前有所减少。12称量前(g)168.3172.3称

14、量后(g)168.9173细胞净重(g)0.60.7悬浮培养后(g)167.6171.7以下为悬浮培养的细胞（图7） 图1 外植体水侵化情况 图2 外植体被霉菌污染情况 图3 外植体被细菌污染情况 图4 外植体褐化情况 图5 长出的愈伤组织情况 图6 疏松型愈伤组织（继代培养情况） 图7 悬浮培养的细胞 图8 组织块切割示意图 （3）胡萝卜素的分离提取和含量测定1）以悬浮细胞为材料测得的吸光度值含量的测定为：0.312、0.306、0.304、0.299、0、293，平均值为：0.303（细胞重量为1.5g）己烷体积为3.1ml（甲醇加入体积：20ml，乙醚加入体积为150ml）-胡萝卜素含量

15、=0.303/0.25/3.1ml=0.390g/ml2） 以新鲜胡萝卜为材料测得的吸光度值含量的测定为：0.937、0.920、0.906，平均值为：0.921己烷体积为 3.8ml-胡萝卜素含量=0.3921/0.25/3.8ml=0.969g/ml3 实验分析与讨论3.1 植物愈伤组织的诱导3.1.1 在培养过程中污染是经常发生的,造成污染的原因很多,如工作环境及仪器的因素、培养基及器皿灭菌不彻底、外植体带菌、操作时不遵守操作规程等,但造成污染的病原主要分为细菌和真菌两大类；3.1.2 真菌性污染主要指霉菌引起的污染。真菌性污染,一般多由接种室内的空气不清洁,超净工作台的过滤装置失效,操

16、作不慎等原因引起. 此类污染可通过完善操作、培养环境、严格操作程序来克服；3.1.3 出现细菌性污染，可能是因为外植体带菌或培养基灭菌不彻底,但主要是操作人员的不慎造成；3.1.4 除要求操作人员严格按照无菌操作顺序操作外,对外植体带菌引起的污染,情况则比较复杂,与外植体的种类、取材季节、部位、预处理方法及消毒方法等密切相关；3.1.5 要取得理想的无菌材料,以春夏生长旺季、当年生的嫩梢为佳,且取材应尽量选择晴天中午进行,或取离体枝梢在洁净空气条件下抽芽,然后从新生组织中取材接种；3.1.6 外植体的彻底消毒是控制污染的前提,应根据不同材料选择合适的消毒剂和消毒方法,有些特殊材料还需进行预处理

17、,为达到最佳消毒效果,对于材料内部带菌的组织,有时还需在培养基中加入适量抗生素，把污染完全控制在可接受的范围；3.1.7 外植体会变黑色或褐色有可能是因为在接种时没等镊子等工具变凉直接切割外植体，导致外植体被烧黑，也可能是因为组织中的酚类化合物被氧化产生棕褐色的醌类物质,进而使整个外植体组织受到伤害而变褐色；3.1.8 而产生的酚类物质导致的褐变又受多重因素的影响，首先要选择适宜的外植体,所选材料的年龄、取材部位、材料的大小及外植体受伤害程度等均能对褐变产生影响，褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系；3.1.9 外植体受伤害程度直接影响褐变,切割时应尽可能减小

18、伤口面积,并缩短切口暴露在空气中的时间；酒精消毒虽然效果较好,但易对材料造成伤害,导致褐化,升汞对外植体伤害比较轻. 且消毒时间越长,消毒效果越好,但褐变越严重. 因而,选择合适的消毒剂和消毒方法至关重要；3.1.10 此外, 将易于褐变的外植体放在黑暗条件下培养一段时间,连续转移,进行预处理,选择合适的培养基、在培养基中加入抗氧化剂和活性炭等都会有效控制褐化的发生；3.1.11 影响水侵化的原因可能是配置培养基时琼脂较少，导致培养基较稀，也可能是因为激素的种类、浓度等影响水侵化，也可能是因为外植体的取材部位，或是取材大小偏小，培养条件不适宜等因素影响使外植体水侵化。3.1.12 可通过适当增

19、加琼脂浓度，减少蔗糖含量（降低渗透势），降低激素浓度，降低温度，改变通风换气条件来减少水侵化的发生；3.1.13 而其中的一块胡萝卜未受污染，未受水侵化，未褐变，也未长出愈伤组织，可能是因为接种材料的问题，也可能是因为操作该切除的部分未切除，也可能是因为培养基的问题，营养不够充分或配比有问题，也可能是因为外植体受到支原体污染未发现影响外植体生长；3.1.14 而其中一块长出愈伤组织的，愈伤组织很少，主要是在外植体组织的外围，白色晶体，之所以相对别人的比较少，可能是因为培养材料消毒未消毒干净，操作时出现问题，也可能是因为培养基配比不好导致愈伤组织不能很好地被诱导等原因导致愈伤组织很少，而培养条件

20、与别人相同，故应该不是培养条件的问题。3.1.15 而有的同学的外植体在第一周观察时未发现污染，但在后来的培养时，发现其不仅不长愈伤组织，而且外植体块发白或死亡，这可能是因为培养基未配置好而导致的问题，也可能是因为培养材料的问题。3.2 植物愈伤组织的再分化诱导3.2.1 光照的强度和时间对胡萝卜愈伤组织的分化影响非常大, 光照时间过长, 强度过大, 愈伤组织容易变紫或褐化；3.2.2 植物愈伤组织的再分化诱导与愈伤组织的诱导的条件不同之处在于再分化诱导需有光照，才能成功再分化出苗长成植株;3.2.3 再分化诱导中也要严格注意无菌环境，在无菌环境下操作，不要发生污染，水侵化等现象，也要注意培养

21、基的配置，激素不要加错，否则再分化诱导不能成功再分化；3.2.4 在使用酒精灯时要小心，尤其是戴无菌手套，酒精干了再开始点火，否则容易使手套点燃烫伤手，若酒精灯好久都不能点着，想要其他办法使其点燃，小心烫手。 3.2.5 植物组织培养中植物激素使用：物组织培养中关键性激素是生长素和细胞分裂素；同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向；先使用细胞分裂素，后使用生长素，细胞既分裂也分化。3.3 植物细胞的悬浮培养以及胡萝卜素的分离提取和含量测定3.3.1 之所以要进行继代培养，是因为愈伤组织诱导得到的材料是致密型愈伤组织，细胞间隙小，不利于单个细胞的培养、原生质体的制备、

22、细胞融合；3.3.2 继代培养中2,4-D：KT=1:1，相对于愈伤组织的诱导来说，KT（细胞分裂素）的含量增加，形成的细胞比较大有利于后续的实验；3.3.3 一个成功的悬浮细胞系一般来说具备以下3 个特征:一是悬浮培养物分散性良好, 细胞团较小; 二是均一性好,细胞形状和细胞大小大致相同, 悬浮系外观为大小均一的小颗粒, 培养基清澈透亮, 细胞色彩呈鲜艳的乳白或淡黄色; 三是细胞生长迅速;3.3.4 细胞悬浮培养的条件：于培养基中生长或维持。培养基成分与继代培养相同，只是不加入琼脂。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以子。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通

23、入CO2和空气，以保证足够的气体交换。 通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。3.3.5 由固体培养转向液体培养，对细胞而言的差别是：固体培养基有让组织和细胞附着和固定的作用，只能吸收组织块周围的营养，而液体培养基使植物细胞分布较均匀在液体培养基中，能较充分地吸收营养，但无法附着和固定； 3.3.6 影响悬浮系建立的因素包括起始愈伤组织的质量, 起始培养密度; 培养基; 培养条件如培养温度, 继代周期、继代方式等；3.3.7 用于建立悬浮细胞系的愈伤组织要求分散性好, 增殖快, 再生能力强, 一般来说其外观呈乳白色或淡黄色, 松散易碎；3.3.8 由外植体诱导来的愈伤组

24、织往往有多种类型, 选择合适的愈伤组织类型或将已获得的愈伤组织进行巧妙的继代得到松散的胚性愈伤组织至关重要；3.3.9 在悬浮细胞培养体系中, 接种初期细胞起始密度对细胞的生长非常重要, 只有当起始细胞密度超过细胞生长的某一临界密度时培养细胞才能生长, 悬浮细胞的起始密度一般在( 0.52.5) 105个/ml ；3.3.10 胡萝卜素易被氧化，见光易分解，故-胡萝卜素含量的提取须在遮光条件下进行；3.3.11 在提取胡萝卜素和测定胡萝卜素时，所用试剂甲醇、乙醚、以及己烷都属于对人体有害的物质，在使用时都要小心，甲醇进入人体会导致失明，乙醚吸入量过多有麻醉的效果（故要在通风处使用乙醚），己烷也

25、有剧毒，在使用时要使用手套；3.3.12 在做分光时，加入4ml的己烷在表面皿上来溶解胡萝卜素，在往比色皿中加时，体积变少，这是因为己烷易挥发，挥发的很快，再加上物质的溶解，导致了体积的减少；3.3.13 由新鲜胡萝卜中提取测定的-胡萝卜素含量远远大于从悬浮细胞中的测定的-胡萝卜素含量，这可能是因为悬浮细胞培养的时间过短，还未出现很明显的增殖现象，导致其胡萝卜素含量远远小于新鲜胡萝卜中的胡萝卜素，有的组的也可能是因为培养基被污染，导致细胞死亡，胡萝卜素含量偏少。附：培养基母液的配置仪器和用品试剂:MS培养基的配制方法一览表母液的配制 为了避免每次配制培养基时都要对所需的各种成分进行称量，人人们便把培养基中必需的一些物质按原量的10倍、100倍或1000倍称量后放在一起，成为一种浓缩液。这种浓缩液就叫“母液”。 大量元素：一般配成使用浓度的10-20倍，浓度太大的母液在冰箱保存时会