武汉大学微生物工程期末考试重点(排版调整后)

1、第一章 绪论微生物工程 利用生物特性和发酵理论，通过现代化的工程技术手段，进行工业化规模生产，使受培养的微生物或动植物细胞积累所需产品的一门技术学科。是生物技（遗传工程、细胞工程、微生物工程（又称发酵工程）、酶工程（又称生化工程）和生物反应器工程。）的重要组成部分。微生物工程组成上游工程：菌种的特性与选育；培养基的配制、选择及其灭菌理论。发酵工程：发酵醪的特性；发酵机理；发酵过程动力学；空气除菌；微生物对氧的吸收与利用；微生物的培养方式及自动化控制等。下游工程：发酵液预处理；初步纯化（即提取）；高度纯化（即精制）；成品加工。发酵（工业上的）泛指利用微生物制造或者生产某些产品的过程，包括：1、

2、厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2、 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。微生物发酵生产的特点1、 一步生产：微生物发酵是有一系列极其复杂的生化反应组成，反应所需的各种酶均包含在微生物细胞内。一次它“吃的是草”产出的的“牛奶”。而用化学方法合唱，等到“牛奶”则需要许多步骤才能完成。2、 反应条件温和：因酶的最适反应条件是常温常压；而化学合成则需要在剧烈的反应条件，如高温、高压、强酸、强碱以及金属催化剂的参与下才能进行。3、 原料纯度要求低：常以农副产品作原料，如薯干、麸皮。原料来源丰富，价格低廉，而化学合成法的原料纯度要求高，较

3、昂贵。4、 设备通用性：由于微生物发酵一般都是纯种发酵，所以必须有培养基灭菌系统和空气除菌系统，而化学工程就不需要这些设备：对微生物发酵来说，无论好氧发酵还是厌氧发酵，它们的发酵设备都大同小异，即好氧的一般都用搅拌式发酵罐加空气过滤系统，厌氧发酵都用密封式发酵罐。5、 对环境的污染相对较小：发酵所用的原料是农副产品，废水中虽然生物需氧量（biological oxygen demand简称BOD）、化学需氧量（chemical oxygen demand简称COD）较高，但有毒物质少；化学合成法除强酸强碱等剧烈条件外，还常用些重金属作催化剂，因此排出的废水毒性较大。6、 反应液的流体力学性质不

4、同：发酵醪中包括有固相（如淀粉颗粒，微生物菌体）、液相（如发酵培养基）和气相（如通入的氧气，产生的二氧化碳），是一类非牛顿流体，在这种流体中质量传递、动量传递等特性与化学工程中的牛顿流体有很大的不同，不服从牛顿力学规律。微生物工程发展简史1. 自然发酵期：只知其然而不知其所以然的时期2. 奠基期：纯培养技术的建立是第一代微生物发酵技术3. 发展期：一系列新技术的建立，使微生物发酵技术得到快速发展4. 发展趋势：第三代微生物发酵技术微生物工程发酵的流程微生物工程的应用领域涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题一、 微生物工程在医药工业中的应用二、 微生物工程在食品工业

5、中的应用三、 微生物工程在农业中的应用四、 微生物工程在化工能源领域中的应用五、 微生物工程在环保领域的应用六、 微生物工程在冶金领域的应用七、 微生物工程在高新技术研究中的应用第一章 生产中常用菌种的分离、选育和保藏微生物工程对菌种的要求1、 操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离。2、 稳定性生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它代谢产物少。3、 遗产稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，不易变异退化4、 安全性：是非病原菌，不产有害生物活性物质或毒素生产用菌种的分离一、 菌种的来源 根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买。从大自然中

6、分离筛选新的微生物菌种。基本程序：采样预处理富集培养筛选鉴定新种分离与筛选的步骤1定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。2采样：有针对性地采集样品。3增殖：人为地通过控制养分或者培养条件，使得所需的菌种增殖培养后，在数量上占优势。4分离：利用分离技术等到纯种。5发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最是温度、最适pH值、提取工艺等。生产用菌种的选育工业菌种的选育： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质

7、或增加新的性状。菌种选育1杂交育种：借助有性重组，是不同菌种的遗传物质得以交换。2原生质融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换3基因工程育种：定向育种，技术含量高，应用面广。4自然选育5诱变育种菌种保藏的主要方法 斜面保藏法和矿物油保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 低温保藏法 悬液保藏法保藏机构的主要保藏方式：真空冷冻干燥保藏法第二章 微生物的代谢调节和代谢工程代谢概论：代谢（metabolism）：细胞内发生的各种化学反应的总称分解代谢(catabolism)；合成代谢(anabolism)代谢调节(regulation of metablism）：是指微生物

8、的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。酶量的调节；酶活性的调节微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照人们的愿望，生产有用的微生物制品。代谢调节方式细胞透性的调节代谢途径区域化代谢流向的调控代谢速度的调控代谢速度的调控：初级代谢和次级代谢1初级代谢：一般将微生物通过代谢活动所产生的自身繁殖所必需的物质和能量的过程，成为触及代谢，该过程所生产的产物即为初级代谢产物，如氨基酸、核苷酸，以及酶或辅酶等。次级代谢：是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前提，合成一些对于该微生物没有明显的生理功能且非其生长繁殖所必需的物质的过程。这一过程的

9、产物，即为次级代谢产物，如抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等。代谢工程概念代谢工程是指利用基因工程技术，定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的大写途径，产生新的代谢产物的工程技术领域。代谢工程主要是引入了代谢网络理论。这个理论将细胞的生化反应以网络整体来考虑，而不是孤立地来考虑。1、 改变代谢途径1.1 加速限速反应1.2 改变分支代谢途径流向1.3 构建代谢旁路1.4 改变能量代谢途径2、 扩展代谢途径3、 转移或构建新的代谢途径 3.1转移代谢途径 3.2构建新的代谢途径代谢调控在发酵工业中的应用代谢条件的控制-

10、遗传学方法1、营养缺陷型突变株的应用2、抗反馈控制突变株的应用3、选育组成型和超产突变株4、增加结构基因数目发酵条件的控制-生物化学方法1 添加前体物绕过反馈控制点2 添加诱导剂3 发酵与分离过程耦合4 控制细胞膜的通透性5 控制发酵的培养基成分 微生物代谢产物的过量生产提高触及代谢产物的产量的方法提高次级代谢产物的方法高浓度微生物的培养 第三章 发酵工艺条件的确定工艺条件控制的目的：为生产菌创造一个最适的环境，使我们所需要的代谢活动得以最充分的表达。培养基的选择和确定一、培养基的营养成分 微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子

11、化合物，再借助细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。 1.能源自养菌：光、氢、硫胺、亚硝酸盐、亚铁异养菌：其余的有机物分解2. 碳源：甲醇、乙醇碳素化合物构成菌体成分的重要元素种类：糖（单糖中的己糖，寡糖中的蔗糖，麦芽糖，多糖中的淀粉，纤维素，半纤维素，甲壳质）葡萄糖（最易利用的糖，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。）淀粉（经胞外酶水解呈单糖后再被吸收利用）糖蜜（蔗糖厂的副产物）有机酸：糖酸，柠檬酸，琥珀酸脂肪酸油和脂肪（微生物的脂肪酶作用下生成甘油和脂肪酸）醇（甘露醇，甘油，低浓度的乙醇）正烷烃（从石油裂解中得到的14C到18C裂解物）3.氮源：豆饼或蚕蛹水解液，味精废液、玉米浆

12、氮素化合物分为有机氮和无机氮有机氮（花生饼粉，黄豆饼粉，棉籽饼粉）丰富的蛋白质和多肽和有力的氨基酸，还有少量的其他物质无机氮源（蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，麸皮，氨水）微生物利用速度快（速效氮），但是应注意pH的变化 4.水良好的溶剂， 5.无机元素主要元素和微量元素。 6. 生长因子微生物生长不可或缺的能够促进生长的物质二、培养基的用途 （一）培养基的分类 （1）按培养基组成物质的化学成分：合成培养基、天然培养基 （2）按物理性质：固体培养基，液体培养基 （3）按用途：选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等 （二）、发酵生产中的培养基类型 筛选菌种；保藏菌种；检验杂菌；培养种子；发酵生产 所有发

13、酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。 依据生产流程和作用分为：1 斜面培养基；2 种子培养基；3 发酵培养基三、发酵培养基的选择(1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。(2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。(3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。(4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。(5)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。(6)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。(7)尽量减少副产物的形成，有利于产品的分

14、离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。四、培养基确定方法（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习性、生理生化特性和一般的营养要求。（2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。（3）最好先选择一种较好的合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验; 然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。（4）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，先确定一个培养基配比。（5） 有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通

15、过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。（6）根据生产和科学研究的需要选择培养基(7)根据经济效益选择培养基原料。发酵过程的种类1、分批培养2、补料分批培养3、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵。优点：放掉部分发酵液，再补入部分料液，使得代谢有害产物得以稀释，有利于产物合成，提高了总产量。缺点：代谢产生的前体物被稀释，提取额的总体积增大。 4、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，这个过程中的菌的

16、浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。代谢参数按性质分可分三类：1物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气 流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等。2化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等。3生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等。环境条件：营养要求、培养基浓度、pH条件、对氧的需求、对二氧化碳的需求。影响发酵的因素及控制方法：1.温度：冷却是主要的方法，通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温，如果气温较高，冷却水温度也较高时，多采用冷盐水进行降温。发酵罐的热交换装置：罐外夹套罐内蛇管、列管Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q

17、辐射2.pH：3.氧：由此可知，只有使溶氧浓度高于其临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量。如果溶氧浓度低于临界值，则菌体代谢受到干扰。氧是制约发酵进行的重要因素调节通风与搅拌；限制基础培养基的浓度4.CO2：调节通风与搅拌；补料控制发酵过程泡沫产生的原因（1） 通气搅拌的强烈程度（2） 培养基配比与原料组成（3）菌种、种子质量和接种量（4）灭菌质量泡沫形成的原因（1） 气液接触（2） 含助泡剂（3） 起泡速度高于破泡速度 起泡的危害：（发酵设备的利用率，增加菌群的非均一性，增加染菌机会，）1.降低生产能力2.引起原料浪费3.影响菌的呼吸4.引起染菌除泡方法：物理消泡法原 理

18、靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。方 法罐内消沫法：罐外消沫法：优 点不需要引进外界物质、节省原材料、减少污染机会缺 点不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。化学消泡法（消泡剂要求：（1）在起泡液中不溶或难溶（2）表面张力低于起泡液 （3）与起泡液有一定程度的亲和性（4）与起泡液不发生化学反应 （5）挥发性小，作用时间长1.天然油脂2.聚醚类消泡剂3.高碳醇4.硅酮类第四章 微生物反应动力学微生物反应动力学：研究各种环境因素与微生物代谢活动之间相互作用随时间而变化的规律发酵动力学分类根据细胞生长与产物形成有否偶联进行分类1 生长产物合成偶联

19、型2 生长产物合成半偶联类型3 生产与产物合成非偶联类型图分批培养中细胞的生长动力学Monod方程： S crit 临界底物浓度，比生长速率达到最大比生长速率 max时的最低底物浓度。对于任一营养物质 S S crit，为非限制性底物 S S crit，为限制性底物 (一)生产连动型产物形成(I型发酵)生长速率、基质消耗qk、产物形成qp（二）部分生长连动型产物形成(II型发酵)（三）非生长连动型产物形成(型发酵)连续培养的优缺点：优点：1、 可以提高设备的利用率和单位时间产量，只保持一个期的稳定状态。2、 发酵中的各参数趋于稳定，便于自动控制。3、 易于分期控制，可以在不同的罐中控制不同的条

20、件。单级连续培养稳态标志：细胞生长速率与稀释速率相等。第五章 培养基的灭菌及空气净化第三节 培养基灭菌的工程设计根据微生物热死灭方程（，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的，因此在工程设计中 -dt/dN=k N 常取 N=10-3K：比热死速率常数（min-1）t：时间（min）N：任一时刻的活菌浓度（个/L）分批灭菌1， 分批灭菌的设计在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。连续灭菌流程2-14 5.10（a）是重点连续灭菌与分批灭菌的比较1.连续灭菌的优缺点：优点：保留较多的营养物质；容易放大；较易自动控制；糖受蒸汽的影响较少；缩短灭菌周

21、期；在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均匀。缺点：设备比较复杂，投资较大。2.分批灭菌的优缺点：优点：设备投资较少：杂菌的危险性较小：人工操作比较方便；对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点：灭菌过程中整齐用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵罐。空气除菌的方法辐射灭菌 加热灭菌 静电除菌 介质过滤在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果I.生产菌失去生产能力 II杂菌生长速度比生产菌更快，使得发酵罐悲剧 III.使提取精致困难，或被降解。IV.裂解生产菌工业上处理措施：I必须灭菌II.发酵的空气必须经过除菌处理 III.设备应严密，发酵罐维持正压条件 IV

22、.物料应灭菌灭菌的方法：化学法：化学药剂灭菌物理法：射线灭菌 干热灭菌 湿热灭菌 过滤除菌 对于培养基和发酵设备，最有效、最常用的灭菌方式就是蒸汽灭菌（湿热灭菌）。介质过滤除菌的机理1直接拦截：流体中的基本过滤机制，本质是一种筛分效应，机械拦截颗粒，例如：一种简单的筛网可以拦截尺寸大于其孔径的颗粒。2惯性撞击：尺寸小于滤材孔径的颗粒的辅助拦截方式，流体携带的颗粒由于质量和线速度而具有直线运动的惯性，颗粒离开流体主流而撞击到滤材上。3扩散拦截：气体分子 (作随机运动) 碰撞小颗粒或雾滴；布朗运动(Brownian motion)碰撞的结果，增加了颗粒碰撞过滤介质的机会；仅在气体中有效。对小颗粒有

23、奇效，但是也只对尺寸小的有效。容易受到湿度影响。过滤介质的过滤 / 分离效率由于直接拦截、惯性撞击、扩散拦截的共同作用而增强 。空气过滤除菌流程：粗过滤器压缩机贮罐冷却器旋风分离器冷却器丝网过滤器加热器过滤器。分析：1.两级冷却、分离、加热的空气过滤除菌流程特点是：两次冷却，两次分离， 适当加热。2.冷热空气直接混合式空气过滤除菌流程可省第二冷却分离设备和空气再加热设备，流程比较简单，冷却水用量较少，利用压缩空气的热量来提高空气温度。3高效前置过滤除菌流程特点：无菌程度高第六章 发酵设备 发酵主要设备为发酵罐和种子罐，它们各自都附有原料(培养基)调制、蒸煮、灭菌和冷却设备、通气调节和除菌设备、

24、以及搅拌器等。发酵罐的类型1 按微生物生长代谢需要分类：好氧发酵罐 厌氧发酵罐2 按照发酵罐设备特点分类：机械搅拌通风发酵罐；非机械搅拌通风发酵罐3 按容积分类：实验室发酵罐；中试发酵罐；生产规模的发酵罐4 按能量输入类型：内部机械搅拌型（标准式发酵罐） 外部机械搅拌型（靠外部循环泵） 空气喷射提升式发酵罐。发酵罐的结构第七章 发酵过程优化与放大发酵罐的比拟放大比拟放大的内容：罐的几何尺寸，通风量，搅拌功率，传热面积和其他方面的放大问题，这些内容都有一定的内在联系比拟放大的依据：1、单位体积液体的搅拌消耗功率 2、搅拌雷诺准数 3、溶氧系数 4、搅拌桨末端线速度5、混合时间 6、通过反馈控制条

25、件，尽可能使重要环境因子一致。生物反应器过程的多尺度理论1背景：测量参数及其变化的意义缺乏理解；最佳工艺控制点为依据的静态操作方法；缺乏以细胞代谢流分析与控制为核心的研究内容。2内容：不同尺度的网络状态关系：生命所特有的信息流、物质流、能量流具有“变化着的结构”，不仅是线性或动力学因素 ；以往各自研究的技术背景从单一尺度去理解和分析研究生物过程的特点，现在跨尺度测量与控制。 3呈网络多输入多输出关系：网络结构表现在不同尺度的网络状态的互动关系 多输入多输出关系 信息流、物质流和能量流生命属性所特有的时空串联反应关系微生物代谢流 网络研究的核心问题4跨尺度观察与操作工业规模的生物过程只能在反应器

26、尺度上进行测量与操作可以从低一层次尺度的规律或性质，来预测研究另一尺度层次的规律或性质多尺度综合与各因子过程的相互量化关系，澄清不同灰度间相互作用和耦合的原则和条件跨尺度操作是难题，分析跨尺度问题往往需要纳入跨学科和跨技术的手段第八章 工业发酵染菌的防治发酵染菌的危害所谓“杂菌”， 是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。发酵过程中染菌的检查判断杂菌的检查方法 目前生产上常用的杂菌检查方法有：显微镜检查：染色 镜检平板划线检查：倒平板 空培养 待测样品划线 培养观察酚红肉汤培养检查：无菌肉汤培