微生物学检验细菌的培养与分离技术.ppt

1、细菌的培养与分离技术,培养基,常用玻璃器材的准备 培养基的成分和作用 培养基的种类 培养基的制备,常用玻璃器材的准备,玻璃器材的种类及用途 玻璃器材的清洗 新购置的玻璃器材：12盐酸浸泡清水清洗 用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷清水清洗 细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷 盛培养基试管和平皿：高压灭菌趁热倒出洗涤剂洗刷清水冲洗 吸管：3来苏浸泡清水冲洗 玻片和盖玻片：3来苏和清洁液浸泡清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗涤 含油脂的器皿：单独灭菌,玻璃器皿灭菌前的准备,玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。,培养基的成分和作用,培养基：是指人工配制的适合细菌生

2、长繁殖的综合营养基质。 营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂 指示剂,培养基的种类（按用途分类）,基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA） 选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如SS平板 增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。 厌氧培养基：用于培养厌氧菌,培养基的种类（按物理性状分类）,液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半

3、固体培养基：含0.30.5琼脂，用于观察细菌的动力。 固体培养基：含22.5琼脂，多用于细菌的分离培养。,培养基制备的一般程序,调配,溶化,矫正pH,过滤澄清,分装,灭菌,检定,培养基灭菌, 基础培养基：121高压蒸汽灭菌15分钟, 含糖培养基：113 灭菌15分钟, 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次, 不耐高温的液体成分：滤过除菌,保存,培养基pH测定及矫正,材料： 待测培养基、 pH7.4标准比色管、4孔比色架、0.02酚红、 氢氧化钠0.1mol/L、1mol/L） 盐酸（0.1mol/L、1mol/L） 蒸馏水 试管（与比色管口径一致）、 刻度吸管（5ml、1ml、0.5ml、0.2

4、5ml）、,pH矫正,水,培养基,培养基,比色管,酚红 指示剂,pH矫正,过酸,相同,过碱,计 算,假设2ml培养基矫正pH至7.4时需0.1mol/L NaOH 0.12ml，现有培养基1000ml，求需加NaOH的量。,2：10000.12：X,设需加NaOH的量为Xml。,X=,0.121000,2, 60ml 0.1mol/L NaOH,60106ml 1mol/L NaOH,细菌的接种与培养,无菌技术 细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。 无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。 细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌 标本的采集 无菌试管、烧瓶的使用,细菌接种的基本程序,灭菌接

5、种环,沾取标本,接种,灭菌接种环,杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本,杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境,细菌接种法,平板划线接种法： 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。 方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本 连续划线法：适用于含菌量较少的标本 液体培养基接种法 穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 倾注培养法:用于细菌计数,分区划线法,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,连续划线法,细菌培养法,一般培养（需氧培养）： 培养温度：35（采用恒温培养箱） 培养时间：1824h 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱 厌氧

6、培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等,细菌在固体培养基中的生长现象,菌落 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。,细菌在液体培养基中的生长现象,混浊 沉淀：多见于链状排列的细菌 菌膜：多见于厌氧菌,细菌在半固体培养基中的生长现象,有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。 无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。,菌 落,菌落与菌苔,细菌在液体培养基

7、中的生长现象,细菌在半固体培养基中的生长现象,有动力 现象,无动力 现象,常用细菌生化反应试验,糖醇类代谢试验,糖发酵试验 甲基红试验 V-P试验 葡萄糖氧化发酵试验（O/F试验） 七叶苷水解试验 半乳糖苷渗透酶试验,糖发酵试验,原理 多糖单糖丙酮酸酸性产物(或产酸产气)pH 指示剂呈酸性变色(若产气者有气泡出现) 培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微量发酵管 试剂：酚红、溴甲酚紫等 结果:培养基呈酸性变色 应用：观察细菌对糖度的 分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定,糖发酵试验结果判断,甲基红试验,原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红后，使甲基

8、红呈现红色反应。此为甲基红试验阳性。 培养基：葡萄糖蛋白胨水 试剂：甲基红试剂 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌,伏普试验（V-P试验）,原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化合物。 培养基：葡萄糖蛋白胨水 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌,葡萄糖,丙酮酸,大量混合酸,pH降至4.4以下,甲基红试剂,培养

9、基变红,甲基红试验,葡萄糖,丙酮酸,乙酰甲基甲醇,二乙酰,V-P试剂,培养基变红,VP试验,脱酸,葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径,葡萄糖,丙酮酸,大量混合酸,pH降至4.4以下,甲基红试剂,培养基变红,乙酰甲基甲醇,二乙酰,V-P试剂,培养基变红,脱酸,蛋白质类代谢试验,靛基质试验 硫化氢试验 苯丙氨酸脱氨试验 尿素酶试验,靛基质试验,原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。 培养基：蛋白胨水 试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛） 结果：加入试剂后，培养基出现红色液面：+ 培养基液面为黄色： 应用：用于肠

10、道杆菌的鉴定,靛基质试验原理,色氨酸酶,色氨酸,靛基质 （吲哚）,玫瑰靛基质 （玫瑰吲哚）,对二甲基氨基苯甲醛,硫化氢试验,原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐结合生成黑色络合物。 培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基 结果：培养基 变黑 为阳性，不变黑为阴性 应用：常用于肠道杆菌的鉴定,苯丙氨酸脱氨实验,原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，可使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合物。 培养基：苯丙氨酸琼脂 试剂：10三氯化铁 结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性 应用：多用于肠道杆菌的鉴定,苯丙氨酸脱氨试验原理,苯丙氨酸,

11、苯丙氨酸脱氨酶,苯丙酮酸,10三氯化铁,绿色化合物,尿素酶试验,原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色。 培养基：尿素培养基 试剂：酚红指示剂 结果：培养基变红：+ 培养基不变色 应用：肠杆菌科属间鉴定,尿素酶试验原理,尿素,尿素酶,氨+CO2,培养基pH升高,酚红呈碱性变色,枸橼酸盐利用试验,原理：某些细菌能力利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐 作为唯一碳源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐和分解铵盐生成的氨，使培养基变碱，是指示剂呈碱性反应。 培养基：枸盐酸盐培养基 试剂：溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色，pH7.6以上呈蓝色） 结果：培养基变蓝：+ 培养基不变色： 应用：肠杆菌科属间鉴别,枸橼酸盐利用试验原理,枸橼酸盐,铵盐,碳酸盐,氨,培养基pH下降,溴麝香草酚蓝 呈碱性变色,培养基变蓝,培养基,糖发酵试验,甲基红试验,靛基质试验,血清学试验,血清学鉴定： 用已知抗体鉴定未知的细