细胞工程重点

1、第1章 简介1. 生物工程（bioengineering）（生物技术）：是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能， 设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系） ，以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。2. 传统生物工程：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程（各个定义见书） 后来：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程以及生化工程。3. 细胞工程（cell engineering ）是以细胞为研究对象，应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的原理或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物

2、体的有关理论和技术方法的学科。 广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。思考题：1细胞工程的概念、研究范畴、在生物工程中与其它工程的关系。 2动物细胞工程发展的主要标志性成就。 3植物细胞工程技术的主要标志性成就。 4细胞工程的作用与应用领域。第2章 细胞工程基础1、 组成细胞的基本元素有哪些？ O、C、H、N、Si、K、Ca、P、Mg，其中O、C、H、N占90%以上。细胞化学物质分为：有机物和无机物。2、 原核细胞与真核细胞有哪些区别？ 原核细胞真核细胞DNA区域没有被膜包被DNA区域有被膜包被没有典型的细胞核和细胞器（只有

3、核糖体）有细胞核（染色体、核仁、核液）和细胞器（核糖体、内质网、叶绿体、高尔基体等）结构简单结构比原核细胞复杂例：细菌、蓝藻例：动植物细胞3、 染色体与染色质有什么区别？ 染色质是指细胞分裂间期遗传物质的存在形式。染色体是指细胞有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质聚成的棒状结构。（染色质由DNA、组蛋白、非组蛋白、少量RNA组成）4、 什么叫细胞周期？ 也称细胞分裂周期，是指一个细胞经生长、分裂增殖成两个细胞所经历的全过程。包括分裂期（M期）与间期，间期由G1、S、G2三个阶段组成。5、 什么叫细胞凋亡，什么叫细胞坏死？ 细胞凋亡也叫细胞程序性死亡，是机体维持环境稳定、由基因控制的细胞自主的有序

4、性死亡。 细胞坏死是受到化学因素（强酸强碱有毒物质）、物理因素（热、辐射）和生物因素（病原体）等环境因素伤害，引起的细胞死亡现象。6、 什么叫细胞全能性？ 是指已分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。7、 什么叫细胞分化？ 是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。8、 什么叫持家基因，什么叫组织特异性基因？ 持家基因：维持细胞的基本结构最低限度功能所不可少的基因。如编码组蛋白、核糖体蛋白等基因。此类基因在所有类型的细胞中均表达。 组织特异性基因：又称奢侈基因，是在各种组织中进行不同的选择性表达的基因，与各

5、类细胞的特殊性有直接关系。如表皮角蛋白基因。9、 植物的组织可分为哪两大类？各自的定义是什么？ 永久组织：在生长发育过程中，细胞分化而失去分裂能力，成为有特定功能的细胞组织，即永久组织。 分生组织：细胞进行迅速的有丝分裂并分化为新生组织及导致植物生长的那部分组织称为分生组织。10、 什么叫无性生殖，什么叫有性生殖？无性生殖：不涉及性别、没有配子参与、没有受精过程的生殖都属于无性生殖。也称为营养生殖。有性生殖：是两个配子融合为一，成为合子或受精卵，再发育成为新一代个体的生殖方式。11、 植物的营养生殖属于其中哪一种生殖方式？ 无性生殖12、 被子植物的花由哪几部分组成？雌雄配子分别位于哪一具体位

6、置？ 花是被子植物的生殖器官，着生在花托上，由花被、雄蕊群、雌蕊群等部分组成。13、 动物受精卵的早期发育一般都要经过哪几个阶段？卵、囊胚、原肠胚、神经胚、器官发生。第3章 植物组织与器官培养1、植物组织培养：是指将植物组织（如花药组织、胚乳、皮层等）给予适当的培养条件下，诱导其长成新的完整植株的一种实验技术。2、试管植物：植物组织培养 再生的植物3、细胞全能性：是指已分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。4、植物组织培养再生植株的途径：器官发生途径、体细胞胚发生途径5、植物的器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（ 愈伤组织） 分化

7、形成不定根（adventitious roots） 、不定芽（adventitious shoots） 等器官的过程。6、植物细胞脱分化：是已有特定结构和功能的植物组织的细胞，在一定的条件下被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程。7、愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团。即由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。8、外植体：植物体上切取下来进行培养的部分组织或器官。即植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。9、离体培养条件下， 经过愈伤组织再分化器

8、官一般要经过四个生长阶段。（简答） （一）启动期：诱导外植体细胞脱分化和分裂。 （二）外植体经过诱导形成愈伤组织。（愈伤组织的诱导与继代培养） （三）拟分生组织的形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后， 首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群， 通常称之为“生长中心”， 也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。 （四）器官原基及器官形成。通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：先芽后根、先根后芽、同时生根发芽。10、体细胞胚：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。11、原生质体

9、：是去除细胞壁后裸露的球形细胞。12、植物激素定义与种类和作用（简答） 植物激素：自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯等生长素：促进细胞分裂、诱导根的分化。常用的有吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA)细胞分裂素：促进细胞分裂、诱导芽的形成。常用的有6-苄氨基嘌呤（BA）、6-呋喃氨基嘌呤（又称激动素，KT）赤霉素（GA）：可以调节生长和影响发育过程，包括促进茎的延长、发芽、种子休眠、开花、性别表现、叶和果实的老化机制。乙烯：促进果实成熟。13、 植物细胞常用培养基（选择和简答） （1）

10、富盐平衡培养基：MS、LS、BL、BM、ER。特点是：无机盐浓度高，微量元素种类齐全、浓度高；元素间比列适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力，稳定性好，营养丰富，一般培养时无需再加入有机成分。 （2）高硝态氮培养基：B5、N6、SH。特点是：硝酸钾浓度高，氨态氮浓度低，含有较高浓度的硫胺素（VB1) （3）中盐培养基：Nitsch、Miller、H。特点是：大量元素无机盐是MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量增高。维生素种类比MS增多，例如增加了生长素、叶酸等。（4）低盐培养基：White、WS、HE、HB。特点是：无机盐、有机成分含量浓度低，多用做生根培养的培养基。14、植物胚胎培养

11、：指对植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。15、毛状根：又名发状根，是植株或组织、器官受到发根农杆菌感染后而形成的类似头发一样的根组织。16、毛状根属于激素自养型17、毛状根培养生产次级代谢产物 青蒿毛状根：青蒿素（治疗疟疾） 长春花毛状根：长春花碱（治疗癌症） 紫草毛状根：紫草宁（治疗肝炎） 人参毛状根：人参皂甙（增强体质）第4章 人工种子与植物脱毒1、人工种子：又称合成种子或体细胞种子，是指将植物离体培养的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中的类似种子的颗粒。2、人工种子与天然种子具有类似的结构： 1）人工种皮外层 2）人工胚乳3

12、）胚状体和芽（核的部分）3、植物脱毒是利用物理、化学或生物学方法脱出植物所感染的病毒，在无菌条件下培养不带病毒的植株，进行快速繁育无病毒种苗的技术。4、植物脱毒方法 物理方法（高温、低温） （一）高温处理：一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40）易钝化失活，繁殖力下降，失去侵染能力。 该方法对圆形病毒、线状病毒有效，但对杆状病毒效果不好。（1）温汤处理：放50 热水浸数分钟至几小时。（2）热风处理：在室内或生长箱中，以35-40 温度处理几十分钟至数天。 （二）低温处理：降低植物温度可使病毒活力下降。 化学方法 用放线菌酮、三氯唑核苷、孔雀绿、硫脲嘧啶、8-氮鸟嘌呤等可以抑制植物体

13、内病毒的复制 生物方法1）基本原理 病毒在植物体内的分布具有不均匀性1943y，怀特就发现植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒。茎尖培养、花器培养成为获得无病毒植株的重要途径。茎尖培养特点：周期短、效率高 茎尖越小，病毒含量越低，但其营养、水分含量也低，对培养基要求越高，茎尖通常取材0.20.5mm大小。茎尖培养结合高温处理法脱毒效果更好第5章 植物细胞培养与次级代谢产物制备1、 植物细胞培养：是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖获得大量细胞群体的一种技术。（区别植物组织培养） 植物组织培养：是指将植物组织在适当条件下诱导长成完整植株的技术。2、 植物单细胞分离与小规模培养 单细

14、胞分离（一）酶解法根据细胞壁的组成特点，用专一性水解酶将壁物质分解掉，从而释放出细胞。（二）愈伤组织诱导法由植物组织培养获得愈伤组织，继代培养使愈伤组织大量增殖，再通过振动、酶解等方法使细胞分离 植物单细胞小规模培养 一）看护培养是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。（二）饲养层培养是把处理过的（X射线处理）无活性的或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长的方法。具体方法有4种：1）双层滤纸植板培养：2）饲养细胞与要培养的细胞共同混合于琼脂培养基中。3）饲养细胞与要培养的细胞混合于琼脂

15、培养基中，前者放于下层，后者位于上层。4）饲养细胞与要培养的细胞一起培养于液体培养基中。（三）液体浅层静置培养将一定密度的悬浮细胞接种在培养皿或三角瓶中封口静止培养。（四）细胞同步化培养（1）体积选择法：不同孔径筛网逐层过滤（2）冷处理法：先4 低温处理，再加新鲜培养基培养。（3）饥饿法：（4）抑制法：加尿苷、5-氟脱氧尿苷、秋仙等抑制细胞分裂。3、细胞系：是以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。细胞株：指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。4、 植物细胞悬浮培养的生物反应器：机械搅拌式生物反应器、鼓泡式生物反应器、气升式生物反

16、应器5、 细胞固定化：指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面、培养液呈流动状态进行培养的一门技术6、植物细胞常采用的固定化方法有：凝胶包埋、表面吸附、网格或泡沫材料固定、膜固定（包括中空纤维）。（方法+例子）7、固定剂：（多选）由带电多聚物的离子交联形成胶体：海藻酸盐、角叉藻聚糖。由热的多聚物冷却形成胶体：琼脂、琼脂糖、角叉藻聚糖。由发生化学反应形成胶体：聚丙烯酰胺。8、 例子（一）海藻酸盐固定化 （二）卡拉胶固定化（三）琼脂糖固定化9、 初级代谢产物：通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必须的物质。如：氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素10、 次级代谢产物：通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构

17、比较复杂的小分子化合物。如：抗生素、激素、生物碱、毒素。第6章 原生质体培养与诱变1、 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露的细胞。2、 原生质体的制备/分离纯化（简答） 1）用于分离原生质体的材料准备 无菌试管苗叶片、上胚轴和子叶、培养细胞 2）酶处理（纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、琼脂酶） 酶解法具有条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高等优点。 酶解法大量制备原生质体一般包括：取材消毒、酶解制备、原生质体收集 3）、原生质体的收集和纯化（理解+阐述） 飘浮法：原生质体比重较小，能在具有一定渗透压的溶液（如25%的蔗糖溶液）中漂浮，然后用

18、吸管收集。常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。 沉淀法与漂浮法结合 见书：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll 飘浮一次。 过滤-离心法：40-100um筛网出去未消化的细胞、细胞团、碎片，在适当的溶剂中低速离心收集细胞沉淀。第7章 细胞融合与体细胞杂交1、 细胞融合：指将两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。2、 同核体：基因型相同的细胞融合成的融合细胞。3、 异核体：来自不同基因型相同的细胞融合成的融合细胞。4、 对称融合：两个完整的细胞间的融合。5、 不对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另一个完整的细胞进行融合。6、

19、 细胞融合的具体步骤（简答）：1）两原生质体互相靠近 2）质膜融合形成细胞桥 3）胞质渗透 4）细胞核融合 细胞质膜和细胞质融合后就是细胞核融合，只有细胞核发生了融合，多核细胞才能存活。 含有多个核的异核细胞合并后形成的单核细胞称为合核细胞。 核融合发生在有丝分裂过程中。两个核同时进行有丝分裂，形成一个纺锤体，所有的染色体都排列在一个赤道板上，伴随着细胞分裂就形成了单核的子细胞，其细胞核中双亲细胞的染色体。 不能形成单核细胞的融合细胞会逐渐死亡。7、 融合方法 动物细胞：仙台病毒法、PEG法、电融合法。 植物细胞： PEG法、电融合法。 微生物细胞： PEG法。 生物法（各种病毒）：仙台病毒、

20、疱疹病毒、牛痘病毒、副黏液病毒（多选） 仙台病毒法仙台病毒也称日本血凝病毒HVJ，是RNA病毒。其促进细胞融合的有效部位在于它的膜，被超声波打碎的病毒膜碎片仍具有促进细胞融合的功能。仙台病毒被膜上相对分子质量为53000的糖蛋白与其促融合的能力相关。融合步骤：1）两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透。3）两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体。4）进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。仙台病毒法缺点要提前培养大量病毒。灭活后才能做融合剂使用。操作繁琐。如果灭活不充分，可能感染操作者和亲本细胞。目

21、前已较少使用该法。化学法：（多选）化学诱导剂：NaNO3、高pH的高浓度Ca2+、PEG、溶菌酶、明胶、抗体、植物凝集素、伴刀豆角蛋白A、聚乙烯醇。物理法：电融合法8、 体细胞杂交：指将不同来源的体细胞融合并使之分化再生、形成新品种的技术。9、 杂交细胞筛选的方式：抗药性筛选、营养互补筛选法、物理特性筛选法、荧光标记法。第8章 多倍体与单倍体植物1、 染色体工程：是按照一定的设计，有计划的消减、添加或替换同种或异种染色体从而达到定向改变遗传性状和选育新品种的一种技术。2、 染色体组：生物体配子的全部染色体称为一个染色体组。3、 多倍体：体细胞中含有超过正常染色体组数的个体。4、 同源多倍体：多

22、倍体的染色体来自于同一物种或在原有染色体组的基础上加倍而成，这样的个体称为同源多倍体。5、 异源多倍体：染色组来源于不同物种的个体称为异源多倍体6、 多倍体植物特点（多选）： 体形较大，茎秆粗壮，叶色较深，花冠、花粉粒和果实也较大。 营养成分高。生理代谢功能较活跃，糖类、蛋白质等含量明显提高，抗旱、抗病的能力也较强。 抗逆性强，更易适应生存条件的变化。 生长慢，结实率低。多倍体的利用价值尤其体现在人们利用其营养器官的植物 (如甜菜、甘蔗和烟草等)上。7、 多倍体植物的诱导/培育 化学诱导法：细胞松弛素B、秋水仙素、N2O、CHClF2、聚乙二醇 生物法：杂交法、胚乳培养法8、 单倍体（名解）：

23、是细胞中含有正常体细胞一半染色体数的个体，即具有配子染色体的个体。 用于基因功能的检测第9章 植物离体受精1、 植物离体受精：指在体外无菌条件下培养未受精的子房、胚珠和花粉，使花粉萌发进入胚珠完成受精的技术。第10章 转基因植物1、 转基因植物：是指将外源基因转入到植物的细胞或组织中获得的具有新的遗传性状的植物。2、 转基因方法 第一类：载体介导法（常用），即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中。包括农杆菌介导和病毒介导法。农杆菌介导可采用“共培养法”，有根癌农杆菌和发根农杆菌两种载体系统。野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约20

24、0-800kb。根癌农杆菌介导法见ppt上 第二类：基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中 物理方法包括基因枪转化法(也称微粒轰击法，是将DNA包被到金粒或钨粒中然后把这些粒子加速推进靶细胞。3、 转基因植物生物制药（前景，了解）第11章 动物细胞培养与表达制备药用蛋白1、 动物细胞培养的特点（了解） 动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。 动物细胞倍增时间长，生长缓慢 培养过程中需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。 动物细胞间主要以聚集体形式存在。 原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡 动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一

25、般还需要血清。 对于培养环境极其敏感，包括PH、溶解氧、温度、剪切力等。 细菌、真菌、病毒、支原体均可导致动物细胞培养物的污染。 绝大多数哺乳动物细胞只有贴附在固体或半固体的表面才能生长。2、离体培养的动物细胞可分为两类：贴壁依赖型、贴壁非依赖型3、贴附型细胞：成纤维细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞4、非贴附型细胞：悬浮型细胞 血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞 始终为球形5、培养基： 天然培养基：小牛血清、鸡胚浸出液、组织提取液等。 基础培养基（人工合成）商品种类： 普通培养基：RPMI-1640、DMEM（high /low glucose）、Ham-F12、M199； 专用培

26、养基：神经元培养基、角朊细胞培养基； 限制性培养基： 完全培养基： 无血清：专用培养基+抗生素、缓冲系统、添加的必需生长因子。代替血清。有血清：普通基础培养基+520% FBS 或NBS、抗生素、缓冲系统等。6、 常用的pH调整液：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)液等。7、 细胞中常用抗生素：青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉素（这两种现在用庆大霉素）8、 动物细胞小规模培养（与植物细胞小规模培养相对比） 一、悬滴培养：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及培养液悬挂在盖玻片下，再置放于一凹形载片上，最后用熔蜡密封后

27、放入培养箱中培养。 二、灌注小室培养：细胞培养于密闭小室内，培养液从一侧流入，另一侧流出。培养液可以循环供应。细胞生长可以少受代谢产物积累的影响。 三、培养瓶培养：玻璃、一次性塑料 四、培养板培养：一次性塑料 五、转管培养：管状培养器皿固定于一旋转装置上。 六、转瓶培养：9、 动物细胞大规模培养 一、悬浮培养：少数动物细胞属悬浮生长型。细胞增殖快、产量高、培养过程简单。 二、微载体培养：多孔微载体、实心微载体 微载体的特点：书上 三、中空纤维法（谁在里外） 空心纤维是由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。细胞在其上贴附生长，水分子、营养物质和气体可以透过。 培养

28、系统的核心部分由3-6层空心纤维组成，细胞接种于空心纤维的外腔。10、 动物细胞培养的生物反应器：（类型，了解） 一、柱状中空纤维反应器 二、板框式中空纤维反应器 三、中心灌流式反应器 四、灌流微载体生物反应器五、旋转壁式反应器11、动物细胞表达制备药用蛋白转基因方式1、暂时转染：质粒在宿主细胞中不必停留很长时间，DNA被转录成mRNA，随后翻译成蛋白质，并不进入细胞基因组。如：磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法。2、永久性转染：反转录病毒载体法可以产生永久有效的转染。基因转移的方法1、 物理方法2、 化学方法：DEAE（二乙氨乙基）-葡聚糖法、磷酸钙-DNA共沉淀法、脂质体载体包埋法（转染效率

29、依次增高，最后一种常用）3、 生物学方法：病毒介导的基因转移 常用病毒载体：逆转录病毒载体（单链RNA病毒）、DNA病毒载体（腺病毒载体、牛痘病毒载体）第12章 杂交瘤技术与单克隆抗体（这章做过实验）1、 单抗制备流程：2、 HAT培养基筛选原理（简答） H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAA（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNADNA的合成有两条途径1）正常途径：可以被氨基蝶呤阻断。2）补救途径：需要次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）两种酶的参与。HAT培养基中的A可阻断细胞正常途径合成DNA。融合所用瘤细胞是HGPRT或TK缺陷型，也不能采用补救途径合成DNA。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶