质粒大提--自制试剂配制和操作步骤总结

1、.质粒提取试剂配制和操作步骤试剂配制(小量)1. 1M（M代表摩尔浓度即molL）NaOH (400ml ): 分子量为40，秤取16g NaOH, 溶于400ml DDW中。2. 2M Tris-HCl (500ml): 分子量为121.14, 秤取121.14g Tris,放入干净的500ml烧杯中，加400 ml DDW，置于搅拌器上搅拌溶解，用HCl调节pH值为8.0（首先直接加12M的浓盐酸约20ml，接近8.0时再用1M HCl 调节）, 定容至500ml，4保存。3. 10%SDS (200ml): 称量20gSDS,放入干净的烧杯中，加100 ml DDW，定容到200ml，室

2、温保存。（SDS具有较强的刺激性，称量时一定带好口罩，动作轻柔）。4. Buffer P1 (500ml): 用50ml离心管量取10ml 0.5M的EDTA，然后量取12.5ml 2M 的Tris-HCl，放入干净的烧杯中，加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解，用HCl调节pH值为8.0（大约加12M的浓盐酸1ml ），定容至500ml，4保存。5. Buffer P2（100ml）: 20ml 1M NaOH和10ml 10%SDS放入200ml的玻璃瓶中，然后加入70ml DDW，混匀，室温放置过夜，使其自溶，最后室温保存。(注：不需要定容，严格按步骤操作)。6. Buffer

3、P3 (500ml) ： 秤取147.21g乙酸钾，溶于300ml DDW中，置于搅拌器上搅拌溶解，用冰醋酸调节pH值为5.5，（约加80100ml冰醋酸）, 定容至500ml，4保存。7. Buffer QBT（500ml）：分别称取NaCl 21.915g, MoPS 5.23g, 放于干净的500ml烧杯中，加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解，用1M NaOH调节pH值为7.0（约加1015ml NaOH）,然后加入75ml 异丙醇，定容至500ml，4保存。8. Buffer QC（500ml）：分别称取NaCl 29.22g, MoPS 5.23g,放于干净的500ml烧杯

4、中，加入300ml DDW,置于搅拌器上搅拌溶解，用1M NaOH调节pH值为7.0（约加9ml NaOH,然后加入75ml 异丙醇，定容至500ml，4保存。9. Buffer QF（500ml）：称取NaCl 36.525g, 量取2M Tris-HCl 12.5ml,放于干净的500ml烧杯中，加入300ml DDW，置于搅拌器上搅拌溶解，用1M NaOH调节pH值为8.5 （约加0.1ml NaOH），然后加入75ml异丙醇，定容至500ml ，4保存。10. 配制RNase: (1) 将RNase粉末溶于10mM的乙酸钾（即Buffer P3），配制成浓度为10mg/ml的溶液。(2

5、) 将配好的RNase溶液100加热10min, 随后冷却至室温。(3) 用1M 的Tris-HCl调节pH值至7.4，大约需要0.1体积的Tris-HCl。(4) 分装RNase溶液于1.5ml EP管中，-20保存。试剂配制(大量)1. 1M NaOH (400ml ): 分子量为40，秤取16g NaOH, 溶于400ml DDW中。2. 2M Tris-HCl (500ml): 分子量为121.14, 秤取121.14g Tris,溶于400 ml DDW中，用HCl调节pH值为8.0, 定容至500ml。3. Buffer P2（1000ml）: 称取10g SDS, 放入1000m

6、l的玻璃瓶中，然后加入750ml DDW，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。(注：不需要定容，严格按步骤操作。)4. Buffer P1 (1000ml): 用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml DDW, 用HCl调节pH值为8.0，定容至1000ml。5. Buffer P3 (1000ml) ： 秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml DDW中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。6. Buffer QBT（1000ml）：分别称取NaCl 43.83g, MoPS 10

7、.46g, 加入600ml DDW, 用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。7. Buffer QC（1000ml）：分别称取NaCl 58.44g, MoPS 10.46g, 加入600ml DDW, 用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。8. Buffer QF（1000ml）：称取NaCl 73.05g, 量取2M Tris-HCl 25ml, 加入800ml DDW，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。9. 配制RNase: (1) 将RNase粉末溶于10mM的乙

8、酸钾（即Buffer P3），配制成浓度为10mg/ml的溶液。(2) 将配好的RNase溶液100加热10min, 随后冷却至室温。(3) 用1M 的Tris-HCl调节pH值至7.4，大约需要0.1体积的Tris-HCl。(4) 分装RNase溶液于1.5ml EP管中，-20保存。操作步骤准备工作： 大提质粒的前两天用50ml离心管摇菌，在5-7ml加有氨苄抗生素AMP的LB液体培养基中挑菌，37下摇菌12-16h。 大提质粒前一天将50ml离心管摇好的菌液500ml大三角瓶中加入含有氨苄抗生素AMP的LB液体培养基200ml，37下摇菌12-16h。1. 沉淀菌液：向离心机配套的50

9、ml离心管中，加入30 ml菌液，6000 g离心10min, 大约沉淀菌液200 ml。(注意：配平离心管，离心时要在离心管壁和盖上都做好标记，且离心时写字的管壁侧朝向外，以便容易找到沉淀物)。离好一管，取回弃去上液保留沉淀物，再反复离心直到所有200ml菌液全部离完），打开盖倒置吸水纸上控干。2. 溶解沉淀: 量取10 ml Buffer P1, 加入100l RNase A, 混匀后，加入到离心沉淀的菌中，用振荡器充分溶解菌液沉淀（可用15ml离心管量取， Buffer P1 加入沉淀离心管是管口不要接触，以防互相污染）。3. 加入10 ml Buffer P2，液体呈现蓝色，轻轻混匀，

10、使其充分反应，冰上放置2-3min即可。（此步主要是碱裂解细菌，使其中的蛋白质和DNA变性，反应时间不能太长，否则容易使大肠杆菌的基因组DNA断裂成小片段，污染质粒DNA）4. 加入10 ml 预冷的Buffer P3，轻轻颠倒混匀，直到蓝色全部消失，出现白色蛋白沉淀，冰上放置20min。（此步发生酸碱中和反应，pH值降低，使变性的DNA双链结构恢复，其中的SDS可以充分与蛋白质结合，使其析出）5. 20 min后，6000 g 4离心25min。同时，向柱子中加入5ml Buffer QBT，使其全部流过柱子，平衡柱子。如果是重复使用的柱子，先使其中的HCl全部流尽，然后加满DDW清洗2遍柱

11、子，最后再加入Buffer QBT平衡柱子。6. 剪一小块纱布，折叠4层，放于柱子上部。将离心后的液体缓慢倒入纱布中，最后挤压纱布使其中的液体全部直接过滤到柱子中，使其充分流过柱子。（如果此步不只1个质粒时，挤压不同质粒的纱布时，一定要换手套，避免污染质粒）7. 清洗柱子: 液体全部流过柱子后，向柱子中直接加满Buffer QC，使其全部流过柱子，清洗2遍，弃去废液。8. 洗脱质粒: 向柱子中加15ml Buffer QF，靠重力作用使其全部通过柱子，收集洗脱液。(注：要收集到一个新的管中)9. 沉淀质粒：向收集的液体中，加入0.7倍体积（即10.5 ml）异丙醇，轻轻混匀，6000 g 4离心25 min。（异丙醇可以充分沉淀质粒，但同时会沉淀很多盐分）10. 清洗质粒：离心后，注意质粒贴壁的方向，应从其侧面倒掉废液。然后加入10 ml 70%的乙醇，轻轻晃动（不能用枪吹散，否则会损失很多质粒）。11. 沉淀质粒：6000 g 4离心10min，轻轻吸弃废液，将质粒开盖晾置，使乙醇充分会发。（质粒中的乙醇会影响后续反应中的酶活性）1