血库实验指导

1、广州华兴康复医院医院血库实验指导实验一 ABO血型鉴定 一、正定型法 【目的】通过用标准血型抗体鉴定红细胞膜上ABO血型系统抗原，掌握盐水介质法进行ABO血型系统正定型的基本操作方法和结果判断。 【原理】根据IgM类特异性血型抗体与红细胞膜上特异性抗原结合能够出现凝集反应的原理，用已知IgM类特异性标准抗血清与被检红细胞在盐水介质中反应（室温），若出现凝集现象，表明被检红细胞膜上有与血型抗体相对应的抗原，从而判断和鉴定被检者的血型。 【器材】小试管、尖滴管、载玻片（或有凹槽的玻璃板）或白瓷板、离心机、记号笔、蜡笔、显微镜。 【试剂】标准抗A、抗B血清，生理盐水。 【标本】外周血或静脉血。 【操

2、作】5被检红细胞生理盐水悬液制备：抗凝血离心或红细胞自然沉降后取下层红细胞2滴于小试管中，加人生理盐水2 ml，用尖滴管将红细胞与生理盐水充分混匀，2 500r/min离心3min后弃去上清液，重复洗涤3次后自管底吸取1滴压积红细胞加入19滴生理盐水中，此即为5的红细胞生理盐水悬液。 （一）玻片法 1标记玻片或白瓷板 取洁净的载玻片或白瓷板1块，用蜡笔画出小格，做好编号分别标记抗A、抗B。 2加标准抗血清 在玻片或白瓷板已标记的区域内分别滴加抗A,抗B标准抗血清各1滴。 3加被检红细胞悬液 在滴加抗A,抗B标准抗血清的小格中分别加被检者5红细胞生理盐水悬液各1滴，不断摇动玻片或白瓷板，使血清与

3、红细胞充分混匀，室温放置1530min。 4观察结果 先轻轻摇动玻片，肉眼观察有无颗粒状凝集及凝集程度，再用低倍镜观察，判定阴性、阳性和阳性程度。 5判断结果 (1)凝集结果判断标准：凝集判断标准：红细胞呈均匀分布，无凝集颗粒，显微镜下红细胞分散存在，无凝集靠拢现象为阴性；红细胞出现凝集为阳性。凝集强弱程度判断标准：有助于A、B亚型，类B抗原的发现，在低倍镜下凝集程度强弱判断标准如下。 1)呈一片或几片凝块，仅有少数单个游离红细胞为（4+）。 2)呈数个大颗粒状凝块，有少数单个游离红细胞为（3+）。 3)数个小凝集颗粒和一部分微细凝集颗粒，游离红细胞约占1/2为（2+）。 4)肉眼可见无数细沙

4、状小凝集颗粒，周围有较多的游离红细胞，于镜下观察，每个凝集团中有5-8个以上红细胞凝集为（1）。 5)可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多的游离红细胞（士）。 6)可见极少数红细胞凝集，而大多数红细胞仍呈分散分布为混合凝集外观（mixed field，MF)。 7)镜下未见细胞凝集，红细胞均匀分布为（一）。 (2)血型结果判定标准：见表1。 表1 ABO血型正反定型结果判定 正定型 被检者血型 反定型抗A 抗B A型红细胞 B型红细胞 O型红细胞十 一 A 一 一一 十 B 十 一 一一 一 O 十 一十 十 AB 一 一 一 （二）试管法 1标记试管 取小试管2支，分别标记抗A、抗Bo 2加

5、标准抗血清 分别加人抗A、抗B标准血清各1滴于相应标记的试管中。 3加入红细胞悬液 分别加人被检者5红细胞生理盐水悬液1滴于各试管中，混匀，立即以1 OOOr/min离心lmino 4观察结果 先观察上层液有无溶血现象，再斜持试管轻轻摇动或轻轻弹动，使管底的红细胞慢慢浮起，肉眼观察有无凝集、再用低倍镜观察凝集强弱程度，如轻微凝集或不见凝集，必须将反应物倒于玻片上，再以低倍镜观察。 5判断结果 (1)判断标准：凝集判断标准：完全凝集的管，上层液体清亮、无色，底部有红细胞凝块，管底细胞呈花边状，轻弹试管凝块不散开。完全不凝的管，上层液体清亮、无色，血细胞均匀地沉到管底，边缘整齐，用手指轻弹试管，红

6、细胞像一缕烟似的立即上升，随即成为均匀的悬液。凝集强弱程度：判断标准与玻片法一致。 (2)血型结果判定标准：见表1。 【注意事项】 1严格标记，摇动玻片动作要轻。 2所用器材必须干燥清洁、防止溶血；为避免交叉污染，试管、尖滴管均一次性使用。 3标准血清的质量、性能要符合要求。标准血清从冰箱取出待其平衡至室温后再用，用毕后应尽快放回冰箱保存，减少细菌污染机会。 4操作应按规定的程序进行，一般先加血清，然后再加红细胞悬液，以便核实是否漏加血清。 5玻片法定型时，注意防止悬液干涸，否则易将玻片边缘干涸引起的红细胞凝集误认为抗原抗体反应凝集。 6理论上IgM抗A和抗B与相应红细胞的反应温度以4最强，但

7、为了防止冷凝集现象的干扰，一般在室温（20-24）内进行试验，37可使反应减弱。 7观察结果时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝集以及缗钱状形成的区别，明确凝集和溶血的意义是一样的。 8登记结果及发报告时应仔细记录、严格核对、避免笔误。 9幼儿红细胞抗原未发育完全、老年体弱者抗原性较弱，最好采用试管法鉴定血型。白血病、恶性肿瘤等严重疾病时，红细胞上的抗原可能减弱甚至消失，要结合反定型综合判断血型。亚型红细胞（如A3型）的抗原性较弱，有时会出现混合外观现象（即凝集与不凝集细胞相混合的现象），甚至与较低效价的抗体血清不出现凝集反应（如Ax, Am），要加用抗AB标准血清进行鉴定。 10有些疾病可能

8、使红细胞定型困难。严重的肠道细菌感染，其代谢产物可使红细胞出现类B现象，与抗B标准血清出现凝集假象。严重的细菌感染，可激活正常存在于红细胞上的T抗原，与各型血清中正常存在的抗T反应，使红细胞出现全凝集现象。血清中存在病理性冷凝集素与红细胞上抗原结合，干扰红细胞ABO系统的血型鉴定。部分高球蛋白和异常高球蛋白血症患者（如慢性肝病、多发性骨髓瘤），红细胞血型鉴定可出现困难。在血型鉴定过程中如遇上述情况，必须加做自身血清、红细胞对照，自身红细胞、生理盐水悬液对照，以及通过反定血型、抗体吸收、放散试验和血型物质型别的鉴定，甚至亲属的血型鉴定等家系调查分析来进行综合判断。 11输入异型血或做过与受血者血

9、型不同的异体骨髓、器官移植的患者，在血型鉴定时可能出现混合凝集外观现象。 【方法学评价】 1玻片法定型简便，不需要离心，适用于大规模血型普查。该法仅靠抗原抗体的力量凝集红细胞而无离心加速反应，故反应时间较长，不适用于急诊定型。此外，亚型红细胞抗原和抗体的凝集反应凝集强度较弱，有时容易被忽略而导致定型有误。另外，该法不适用于反定型和交叉配血。 2试管法定型反应快，所需时间短，适用于急诊定型；通过离心作用增强凝集，可发现亚型和较弱的抗原抗体反应，结果准确可靠，为正定型常规使用方法。 【质量控制】 1更换抗血清批号或对实验结果有怀疑时可设阳性、阴性对照。 2应严格按操作规程进行实验。 3红细胞悬液浓

10、度过高或过低，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，容易误判为阴性反应。 4玻片法反应时间不能少于10min,否则较弱凝集不能出现，造成假阴性。 5离心时间和速度应准确，以防止出现假阳性和假阴性结果。 6分型血清效价太低、亲和力不强。如抗A血清效价不高，可将A亚型误定为O型，AB型误定为B型。 7正反定型结果一致才可发报告。 8标记、操作、结果判断、结果记录与报告应仔细核对。 二、反定型法 【目的】通过用标准红细胞与被检血清反应，掌握用盐水介质法进行ABO系统反定型的基本操作方法及结果判断，并验证正定型结果的准确性。 【原理】用已知标准A、B、O型红细胞与被检血清反应，若被检血清与已知型别的标准红

11、细胞出现凝集，则证明被检血清中存在与该红细胞抗原相对应的抗体。反之，若被检血清与已知型别的标准红细胞不出现凝集，证明被检血清中不存在与红细胞抗原相对应的血型抗体，以此反证被检者红细胞上抗原的型别。 【器材】小试管、尖滴管、离心机、显微镜、记号笔。 【试剂】5A、B、O型标准红细胞生理盐水悬液。 【标本】静脉血。 【操作】 1分离血清 将待检血液以2 500r/min离心3min,分离血清。 2标记并加被检者血清 取小试管3支，分别标记A、B、O字样，于各管加人被检者血清2滴。 3加标准红细胞 按标记分别加入5的A、B、O型标准红细胞生理盐水悬液1滴，混匀，立即以1 OOOr/min离心lmin

12、。 4观察结果 先观察上层液有无溶血现象，再斜持试管轻轻摇动或轻轻弹动，肉眼观察有无凝集，再用低倍镜观察。 5判断结果 (1)凝集结果判断标准：同正定型法。 (2）血型结果判定标准：见表1。 【注意事项】 1标准红细胞用3名健康人同型新鲜红细胞混合，用生理盐水洗涤3次，以除去存在于血清中的抗体及可溶性抗原。 2观察结果时若试管中出现溶血现象，表明存在抗原抗体反应并有补体激活，应视为凝集。 3先天性免疫球蛋白缺陷，长期大量应用免疫抑制剂，血型抗体可减弱或消失，造成反定型困难。 4血清中存在自身免疫性抗体、冷凝集素效价增高、多发性骨髓瘤、免疫球蛋白异常均可造成反定型困难。 5由于新生儿体内可存在母

13、亲输送的血型抗体，而且自身血型抗体效价又低，因而出生6个月以内的婴儿不宜做反定型。 6其他与正定型相同。 【方法学评价】试管离心法的灵敏度明显高于玻片法，易于检测出较弱的凝集，故反定型通常用试管离心法。 【质量控制】 1每批测定用标准的抗、抗B及抗A抗B血清作对照。 2老年人血清中抗体水平大幅度下降或被检者血清中缺乏抗A及（或）抗B抗体，可引起假阴性或血型鉴定错误。 3正、反定型血型结果不一致时不能报告结果。 4其他与正定型相同。 实验二 Rh(D)定型【器材】小试管、尖滴管、载玻片（或有凹槽的玻璃板）或白瓷板、离心机、记号笔、蜡笔、显微镜。 【试剂】IgM/IgG混合型抗D血清，生理盐水。

14、【标本】外周血或静脉血。 【操作】5被检红细胞生理盐水悬液制备：抗凝血离心或红细胞自然沉降后取下层红细胞2滴于小试管中，加人生理盐水2 ml，用尖滴管将红细胞与生理盐水充分混匀，2 500r/min离心3min后弃去上清液，重复洗涤3次后自管底吸取1滴压积红细胞加入19滴生理盐水中，此即为5的红细胞生理盐水悬液。（一） 玻片法1快速试验该试验最好在表面温度为2037的观察箱上进行。（1） 在一块玻片上滴1滴试剂。（2） 加1滴等体积全血，混匀。（3） 轻摇玻片，观察凝集结果，判读结果应在2分钟内进行，否则会因为样本干固而引起假阳性。（二） 试管法（1） 用等渗盐水配制3%-5%待检红细胞悬液。

15、（2） 在一块玻片上滴1滴试剂，加1滴全血或红细胞悬液。（3） 1000rpm（150g）离心2分钟或3000 rpm（1000g）离心20秒。（4） 轻轻振荡，悬浮沉积细胞，观察凝集结果。（5） 若反应为阴性、弱阳性或可疑，20孵育15分钟。（6） 1000rpm（150g）离心2分钟或3000 rpm（1000g）离心20秒。（7） 轻轻振荡，悬浮沉积细胞，观察结果。最后，如果使用血清克隆抗-D经20孵育后，反应仍为阴性，那么就需要检测弱D抗原或不完全D抗原的存在。使用血清克隆抗-D（混合型）重复上面操作，然后按下述方法继续试验。弱D抗原（Dweak）试验：（8） 37孵育15-30分钟。

16、（9） 用等渗盐水洗红细胞至少3次，最后一次洗涤后，完全倒掉盐水上清。（10） 用2滴抗人球蛋白试剂于细胞中。（11） 3000 rpm（1000g）离心20秒。（12） 轻轻振荡，悬浮沉积细胞，观察凝集结果。如果反应为阳性，说明存在弱D抗原或不完全D抗原。该试验应同时做阳性，阴性对照试验。（13）判断结果 如阳性对照管出现凝聚，阴性对照管不凝集，再看被检管，若被检管出现凝集，为Rh阳性，若被检管不凝集，则为Rh阴性。【质量控制】 1每批测定一定要做阴性和阳性对照，只有在阳性对照管出现凝集而阴性对照管不凝集的情况下，才能说明被检管的结果是可靠的。 2如结果为阴性，说明被检红细胞上无相应抗原，但

17、由于Du抗原性弱，如被检者无凝集，还应进一步检查以排除Du的可能。实验三 交叉配血试验 一、盐水介质配血法 【目的】掌握盐水介质交叉配血的基本原理、方法和注意事项。 【原理】天然IgM类血型抗体与对应红细胞抗原相互作用，在室温下的盐水介质中出现凝集反应。通过离心，观察受血者血清与供血者红细胞以及受血者红细胞与供血者血清之间有无凝集现象，判断供血、受血者之间有无ABO血型不合的情况。 【器材】小试管、尖滴管、离心机、显微镜、记号笔。 【试剂】生理盐水。 【标本】静脉血。 【操作】 1患者标本准备 （1）分离血清，标记为PS(patient serum)。 (2) 配制5患者红细胞生理盐水悬液，标

18、记为PC(patient cell)。 2献血员标本准备 （1）分离血清，标记为DS(donor serum)。 (2)配制5献血员红细胞生理盐水悬液，标记为DC(donor cell)。 3交叉配血（按1个供血者为例）取小试管2支，分别标明主、次，即主侧配血管和次侧配血管。在主侧配血管中分别加PS2滴，DC 1滴，在次侧配血管分别加DS2滴，PC 1滴，混匀，1 OOOr/min离心lmin。 4观察结果 先观察试管上层液有无溶血，再斜持试管轻轻摇动或轻轻弹动，观察管底反应物有无凝集（必要时用显微镜观察）。 5判断结果 (1)凝集结果判断：凝集结果判断标准同正定型试管法。凝集强弱程度判断标准

19、同正定型玻片法。 (2)配血是否相合判断标准：ABO同型配血，主侧、次侧均无溶血及凝集，配血相合；主、次侧任何一管发生溶血或凝集，暂不可输血，需查明原因。异型配血时（指O型血输人给A、B、AB型，或A、B型输给AB型），主侧无凝集无溶血，次侧有凝集但无溶血，可以输人少量血。如主侧、次侧均无凝集或主侧凝集，需查找原因，暂不能输血。 【注意事项】 1严格三查三对，确保标本、姓名、血型准确无误。 2观察到试管内溶血现象表示配血不合，表明有抗原抗体反应，同时还有补体参与，必须高度重视。 3如主侧配血管凝集，应禁止输血，必须查找原因，另选血源。 4室温控制在（22士2），以防止冷抗体引起凝集反应，影响配

20、血结果的判断。 5盐水配血相合但有反复输血史或妊娠史的受血者，应加用聚凝胺介质、酶介质或抗球蛋白介质配血。 6为确保输血安全，应输同型血，特殊情况下无同型血又必须输血时，可选择O型血输给AB、 A及B型血的患者，或A、B型输给AB型的患者，但主侧管必须无凝集和溶血现象，次侧有凝集但无溶血，方允许少量输入（不超过200m1），但供血者血清中抗A(B)效价要小于1：64。 二、聚凝胺介质配血法 【目的】掌握聚凝胺介质交叉配血的基本原理、方法和注意事项。 【原理】聚凝胺（polybrene），一种高价阳离子季胺盐多聚物，溶解后能产生很多正电荷，可中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距离减少，能引起正

21、常红细胞可逆性的非特异性凝集。如果是抗体致敏的红细胞被聚凝胺凝集，则凝集不可逆。在检测抗体活性的聚凝胺试验中红细胞和血清首先在低离子介质中孵育，促进抗体与红细胞结合，然后加入聚凝胺使细胞聚集。离心后，聚集的细胞不再悬浮，加入重新悬浮液，聚凝胺的聚集作用可通过加入枸橼酸钠而中和，使正常红细胞的聚集解散，而抗体引起的凝集仍存在。 【器材】小试管、尖滴管、离心机、记号笔、显微镜。 【试剂】聚凝胺试剂盒由三部分组成：低离子强度溶液(low ion strength solu-tion, LISS液）。聚凝胺液(polybrene)。解聚液即重新悬浮液(resupension solution)。 【标

22、本】静脉血。 【操作】 1患者标本准备（1） 分离血清，标记为PS。 (2) 配制5患者红细胞生理盐水悬液，标记为PC。 2献血员标本准备 (1) 分离血清，标记为DS。 (2) 配制5献血员红细胞生理盐水悬液，标记为DC。 3交叉配血（以1个供血者为例）取小试管2支，分别标明主、次，即主侧配血管和次侧配血管。在主侧配血管中分别加PS和DC各1滴，在次侧配血管中分别加DS和PC各1滴，混匀，1 OOOr/min离心lmin。 4加LISS液和聚凝胺液 在上述已加好反应物的试管中各加人LISS液0. 6m1(约12滴），混匀后再加聚凝胺2滴，混匀,15s后以1 OOOr/min离心lmin,弃上

23、清液，观察管底红细胞凝集情况，若各试管中的反应物全部出现凝集，说明试剂有效。 5加解聚液 向各管中分别加人解聚液2滴，混匀lmin后以1 OOOr/min离心lmin。 6观察结果 先看上层液有无溶血现象，再斜持试管轻摇或轻轻弹动，先用肉眼观察后，在低倍镜下观察有无凝集。 7判断结果 (1)凝集结果判断：凝集结果判断标准同正定型试管法。凝集强弱判断标准同正定型玻片法。 (2) 配血相合判断标准：同盐水介质交叉配血法。 【方法学评价】 1交叉配血有自动化仪器法及手工配血法，成批量配血（如中心血站）多使用自动化仪器，多数医院输血科或血库仍用手工法配血。另外，卡式配血血型鉴定检测法已成为国际安全输血

24、检查的推荐方法。卡式检测法（微柱凝胺试验）是利用葡聚糖凝胶具有分子筛效应或亲和效应，将红细胞和血清加在凝胶的上部反应，离心后，凝集红细胞将受到凝胶的阻碍而停留在凝胶微柱的上部或凝胶中，则证明发生凝集反应，可判为凝集反应阳性；反之，所有红细胞停留在凝胶柱底部，证明未发生凝集反应，则可判断凝集反应阴性。该法具有：检测项目齐全、应用广（包括常规血型检查，特殊血型检查、交叉配血、抗体筛检，直接抗球蛋白及间接抗球蛋白试验等）。灵敏度高，特别在交叉配血时，能捕捉到十分微弱的抗原抗体反应。特异性强，许多试验中都加人了抗人球蛋白，以促进红细胞的特异性凝集。重复性好，采用标准化定量操作，最大限度减少操作人员的随

25、意性。客观性好，由于采用了凝胶分子筛技术，将凝集红细胞和游离红细胞分离开，使结果一目了然，避免了显微镜下的主观判断影响。可节省样品红细胞、血清和试剂，检测结果可以较长时间保存。操作方式可以采用手工、半自动及全自动模式，灵活方便。尤其是自动化操作，可减少人为误差，保障安全翰血，并可实现计算机管理。不足之处是成本较昂贵。 2盐水介质配血法是常用的方法，其操作简单，反应快速，如有血型不合，可立即显示出来。可以发现临床上最重要的ABO血型不合，但该法只能发现完全抗体，若要检测不完全抗体，则需采用其他方法。故该法只适用于初次受血患者的交叉配血。对有异体输血史、妊娠史和器官移植史的患者不宜采用本法。 3聚凝胺介质配血法可加快凝集反应速度，使原来在盐水介质中不能凝集红细胞的抗体发生凝集，提高反应灵敏度，能检测IgM, IgG等引起溶血性输血反应的几乎所有规则与不规则抗体，适用于各类输血患者的配血。故该法具有快速、灵敏、结果可靠、能检出完全抗体及不完全抗体等优点，目前