第1章++微阵列分析导论.ppt

1、易图永 生物安全科学技术学院生物信息系 二一年三月,生物芯片原理与技术,课程学时安排,学时：50学时 安排：讲课34学时，实验16学时 学分：3分 成绩：考试占70，实验和出勤占30,生物芯片相关书籍,生物芯片分析M.谢纳 著 生物芯片技术邢婉丽 程京 著 生物芯片技术与应用详解G.哈德曼 著 生物芯片马立人 、蒋中华 著 基因芯片数据分析与处理李瑶 著 DNA Microarray Data analysisIiris Hovatta et al. 2005,Iiris Hovatta et al., (2005) DNA microarray Data Analysis, 2nd Edit

2、ion., CSC; 2005.,在许多情况下，生物学问题最终的解决都源于技术上的突破。 Mark Schena,本书共分为十六章，分届于三大部分，第一部分为基础知识，包括概述、微阵列基因芯片制备和检测技术以及统计学基础；第二部分内容是数据处理方法，包括实验设计、图像的获得和数据的前处理、数据的须处理和归一化、差异表达基因分析、芯片数据的可靠性分析、聚类分析和可视化以及微阵列实验中的分类方法；第三部分主要是与数据挖掘和应用相关的内容，包括微阵列技术的标难化、基因芯片数据的基因注释和功能分析、系统生物学及基因调控网络、基因芯片技术的应用从基因筛选到临床诊断、主要数据分析软件的介绍和展望。,芯片打

3、印仪,芯片杂交仪,芯片扫描仪,生物芯片技术简介,每个组织和细胞中包含各种生物大分子，如蛋白质、DNA和RNA，为了解生物大分子与生命现象的关系，需要研究生物中所有不同种类蛋白质和核酸的功能，而传统检测方法一次只能检测一个生物大分子，生物芯片技术提供了高通量检测生物大分子的方法。 生物芯片：把生物活性大分子（如蛋白质和核酸）或细胞等，密集排列在固定的固相载体上，形成微型的检测器件，固相载体通常是硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等。 狭义：微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列等 广义：能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件，主

4、要还包括微流体芯片和“芯片实验室”。,生物芯片主要特点,微型化 自动化 网络化,生物芯片类型,基因芯片gene chip 蛋白质芯片protein chip 组织芯片tissue microarray 微流体芯片和缩微芯片实验室,微阵列(microarray):是一种平面的基质载体，它上面规则地、特异性地吸附着基因或基因产物。,什么是微阵列？,How?,微阵列分析,微阵列分析（microarray analysis):利用微阵列芯片通过一些实验步骤来研究生物、化学及物理方面的问题。 在微阵列分析中，从细胞中抽提得到mRNA，把mRNA进行荧光标记，然后和含有基因序列的玻璃芯片进行杂交。芯片上每

5、个点能和杂交液中的荧光标记的特异性cDNA杂交，使得每个点的荧光信号和基因表达的丰度成正相关。 能够在基因组规模上对基因表达谱、患者基因型、药物代谢、疾病的发生和进展过程进行快速和定量的分析。 应用领域：医学、农业、食品,微阵列的起源,生物芯片是随人类基因组计划启动和实施应运而生； 1991年Fodor等人首先提出DNA芯片的概念； 1991年Affymetrix率先生产世界上第一块基因芯片； 1995年第一块以玻璃为载体的基因芯片在美国斯坦福大学P.O.Brown实验室诞生，由Schena及其同事研究出来的。目的是研究拟南芥的转录因子，从而快速而准确的研究植物的基因表达过程，标志着生物芯片技

6、术步入广泛研究和应用时期； 生物芯片技术已成为功能基因组研究中最基本的实验手段,基因芯片技术的产生和发展,DNA体外聚合 重组DNA技术 PCR（聚合酶链反应）技术 DNA杂交技术,核酸分子固相杂交方法,菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） Southern印迹杂交（Southern blot） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） 反向杂交，基因芯片的前身,探针,探针标记 放射性同位素标记，125I、32P、33P和35S 非放射性标记

7、 荧光法，化学发光法，电化学发光法，生物发光，显色法 探针种类（Probe type） 基因组探针 cDNA探针 寡聚核苷酸探针（Oligo）,探针的来源,DNA探针根据其来源有3种： 一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）； 另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA 探针（ cDNA probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。 此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。,微阵列是如何定义的？,微阵列必须符合： 有规则的； 显微尺度的； 平面的； 特异性的。

8、,吸附在玻璃基片上的靶标DNA分子。单链的靶标DNA分子和溶液中荧光素标记的探针发生杂交结合，使得芯片上的点呈现出荧光信号，信号的强度和对应的基因表达水平成正相关，荧光信号的强度按照彩色模式来赋予不同的颜色，基因的表达情况能够通过检测芯片上不同位置的荧光信号来定量。,规则的微阵列,规则的阵列是指阵列上待分析的单元按照行和列的方式进行排列的集合 微阵列上的点按照行和列规则地排列而非无规则排列；点的大小和点间距均一而非不均一；点的位置明确而非模棱两可。,微阵列定义,显微尺度的点,显微尺度（microscopic):是一个物体若没有显微镜的帮助，不能清楚地被看见。一般以小于1mm为界。 微阵列：光引

9、导原位合成的点：1530m 点制的点：50350m 组织芯片的点：200600m,微阵列定义,平面基片,平面基片是像玻璃、塑料、硅片一样平行不能弯曲的基质载体。玻片是微阵列中用得最为广泛的基质载体。 非平面基片：尼龙膜、硝酸纤维素膜等。 平坦的表面优点：适合大规模自动化生产；为光掩膜、接触式针点样、喷墨式非接触点样和其它制备工序提供了精密的距离，确保制备微阵列的高质量；使扫描和成像变得容易。,微阵列定义,特异性吸附,微阵列上的每一个点能与标记好的探针混合物中的一种分子发生吸附，才能对此基因或基因产物进行精确的检测,微阵列定义,探针混合物中一种标记好的探针分子能和cDNA微阵列芯片上唯一的一个c

10、DNA靶标进行杂交，或者与寡聚核昔酸微阵列芯片上的一组相应的寡聚核苷酸进行杂交。含有短的寡聚核苷酸阵列上的靶标和单一的探针分子杂交时常会产生不能分辨的多个杂交信号。,微阵列的类别,实验设计,每次微阵列分析实验应该包括阳性对照、阴性对照和实验对象,阳性对照是指在微阵列上的点，不管实验对象得到的是什么样的结果，这些点都能产生可按识别的信号。阳性对照产生的可识别信号极大地改善了评估实验数据的能力，特别在实验对象得到阴性结果时尤显突出。阳性对照得到了强烈信号后，就能排除对实验失败的错误解释，例如可排除问题出在杂交、清洗、扫描或数据分析的步骤上。只有阳性对照中也末产生可识别的信号，才能对微阵列分析的阴性

11、结果下一个确切的结论。,阴性对照是指在微阵列上的点，不管实验对象得到的是什么样的结果，这些点都不能产生信号。阴性对照能排除或减小非特异性反应(如染色和交叉杂交)带来的信号而增加实验数据的可信度。若分析时没有阴性对照做参考而对微阵列分析实验下结论是一件很冒险的事。 实验对象是指在实验中要寻找的新信息。这些信息包括基因表达谱、基因型、其他生物过程或途径。,Expression profiling with DNA microarrays,cDNA “A” Cy5 labeled,cDNA “B” Cy3 labeled,Hybridization,Scanning,Laser 1 Laser 2,

12、+,Analysis,Image Capture,A yellow spot a gene that hybridized to both green and red cDNA: expressed both in healthy cells and cancer cells!,实验设计,基因芯片的数据挖掘,微阵列分析的一些应用,发育 人类疾病 药物研发 遗传筛选和诊断,微阵列分析能用于检测不同组织中的基因表达谱。基因表达的信号强度按照彩虹图模式来显示，高水平表达用红色表示，低水平用黑色表示。,微阵列分析应用,发育,微阵列分析应用,人类疾病,正常人和阿尔茨海默症患者的脑组织样品用微阵列技术进行

13、定量分析后显示了一个在患者脑组织中表达上调的基因。这个基因可能与疾病的发生有关。,微阵列分析应用,药物研发,疾病发生伴随着一个基因被激活和两个基因受抑制。用A药物处理后，变化异常的基因回复到正常水平。用B药物处理后，原来变化异常的基因表达也回复到正常水平，但又两个新的基因受到抑制，预示B药物可能存在副作用,总结,微阵列分析是20世纪90年代早期发展的一项革命性新技术。该技术使用了微型化（微阵列芯片）来对基因和基因产物做定量的分析。有较高的分析速度和较好的分析精度，可一次分析人的整个基因组，在10min内定量获得3万多个基因的表达情况。 其发展历史可追溯到20世纪50年代，期间包括发现DNA聚合酶、重组DNA技术和PCR技术。 具有网络化、微型化和自动化特点。 主要包括五个步骤。 可用于发育、人类疾病、药物发现、诊断等研究。,CGH比较基因组杂交技术,是一种将消减杂交、荧光染色体原位杂交（fluorescence in situ hybridization FISH）相结合，用于检测待测组织DNA顺序拷贝数目的变化（缺失、扩增、复制），并将这些异常在染色体上定位的方法。将不同基因组D