第五章-饲料中脂肪酸含量的测定

1、09,级动物科学,1,班,2,班、实验动物,饲料分析技术,畜牧兽医学院动物科学系,吉林大学,金永成,邮箱,电话1,第五章,饲料中脂肪酸含量,的测定,2,脂,类,是一类不溶于水而易溶于乙醇、丙酮等有机溶,剂的有机化合物,以液态或固态形式普遍存在生物界,正常情况下，人体中占,14,20,14,为消瘦,20,则为肥胖,60,为极度肥胖,3,脂类在近代被认识的发展过程,年代,人物,Aron,Evans/Burr,Burr,Halman,Neuringes,观点,脂肪对动物的生长发育是必需的,脂肪缺乏会严重影响动物的生长和繁殖,脂肪缺乏会引起动物皮肤损害和死亡率,花生四烯酸是必

2、需脂肪酸,发现人类必需脂肪酸缺乏症,首例婴儿,报道第一例亚麻酸缺乏病人,发现缺乏亚麻酸的恒河猴子代视力损害,4,1918,1927,1929,1938,1958,1982,1984,脂类的形式,5,脂类的分类及其主要功能,甘油三酯,储存和提供能量,可变脂,提供必需脂肪酸,脂肪,脂类,类脂,5,磷脂,胆固醇,构成生物膜,合成脂蛋白,合成激素等,同磷脂,6,脂类的分类及其主要功能,三酰甘油,甘油,3,份脂肪酸,食物与人体内脂肪的最重要组成形式,3,份脂肪酸与,1,个甘油分子以酯键连接,根据脂肪酸不同，分为,中链三酰甘油,MCT,长链三酰甘油,LCT,7,脂类的分类及其主要功能,LCT and MC

3、T,a physical mixture,l,o,r,e,y,c,l,LCT,Long-Chain Triglycerides,G,as in Intralipid,MCT,Medium-Chain Triglycerides,8,G,l,y,c,e,r,o,l,脂类的分类及其主要功能,Reesterification,再酯化,STG,STG,structured triglycerides in Structolipid,9,脂类的分类及其主要功能,脂肪的功能,供能,9 (kcal/g,能量储存,脂肪组织内三酰甘油,转运形式,脂蛋白,游离脂肪酸,绝缘层：器官保护层,膜的组成成分,脂、蛋白共同

4、构成,细胞膜、神经髓鞘,原性,糖脂类,绝缘体,细胞表面,磷酸甘油酯,抗,免疫调节,类花生酸,如前列腺素,刺激平滑肌细胞收缩,前体,固醇类激素、胆盐、维生素,D,前体,10,脂类的分类及其主要功能,脂肪酸,特征,决定脂肪酸的熔点,链长,C,原子数,熔点,饱和性,双键数：双键数,熔点,11,脂类的分类及其主要功能,一）甘油三酯功能,1,体内贮存和提供能量,2,维持体温正常,3,保护作用,4,内分泌作用,5,有效地利用碳水化合物和节约蛋白质作用,6,机体重要的构成成分,甘油三酯在营养学上的功能,1,增加饱腹感,2,改善食物的感官性状,3,提供脂溶性维生素,12,脂类的分类及其主要功能,二）磷脂,1,

5、磷脂：指甘油三酯中一个或两个脂,肪酸被含磷酸的其它基团所取代的一类脂,类物质,其中最重要的磷脂是卵磷脂,1ecithin,它是由一个含磷酸胆碱基团,取代甘油三酯中一个脂肪酸而形成的,13,脂类的分类及其主要功能,2,磷脂功能,1,提供能量,2,细胞膜的构成成分，促进细胞内外,的物质交流作为乳化剂有利于脂肪的吸,收、转运和代谢,14,脂类的分类及其主要功能,3,磷脂的缺乏,造成细胞膜结构受损，毛细血管,的脆性和通透性增加，引起水代谢紊,乱，产生皮疹,15,脂肪酸,fatty acid,的分类,一、按其碳链长短分类,长链脂肪酸,14,碳以上,中链脂肪酸,含,8,12,碳,短链脂肪酸,6,碳以下,1

6、6,脂肪酸,fatty acid,的分类,二、按其饱和程度分类,饱和脂肪酸,单不饱和脂肪酸,多不饱和脂肪酸,17,脂肪酸,fatty acid,的分类,饱和、单不饱和、多不饱和脂肪酸的结构,18,脂肪酸,fatty acid,的分类,不饱和脂肪酸的类别,母体脂肪酸,棕榈油酸,类别,n-7,7,油酸,亚油酸,亚麻酸,n-9,9,n-6,6,n-3,3,注：每类包含一系列脂肪酸，各脂肪酸能从母体脂肪酸合成,如花生四稀酸,C20:4,n-6,由亚油酸,C18:2,n-6,合成,19,脂肪酸,fatty acid,的分类,n-3,n-6,类,合成途径,Modern Nutrition in Healt

7、h and Disease,第,9,版，第,82,页,年,20,体内多不饱和脂肪酸,摘自,1999,脂肪酸,fatty acid,的分类,21,脂肪酸,fatty acid,的分类,三、按其空间结构不同分类,顺式脂肪酸,cis-fatty acid,反式脂肪酸,trans-fatty acid,22,脂肪酸,fatty acid,的分类,四、营养学上最具价值的脂肪酸有两类,n-3,或,3,系列不饱和脂肪酸,即从甲基,端数，第一个不饱和键在第三和第四碳原子之,间的各种不饱和脂肪酸,n-6,或,6,系列不饱和脂肪酸，从甲基,端数，第一个双键在第六和第七碳之间,CH,3,CH,2,n,CH,2,CO

8、OH,甲基端,羧基端,23,常见的脂肪酸,名,称,丁酸,butyric,acid,己酸,caproic,acid,辛酸,caprylic,acid,癸酸,capric,acid,月桂酸,1auric,acid,肉豆蔻酸,myristic,acid,棕榈酸,palmitic,acid,棕榈油酸,palmitoleic,acid,硬脂酸,stearic,acid,油酸,oleic,acid,反油酸,elaidic,acid,代,号,C,4,0,C,6,0,C,8,0,C10,0,C12,0,C14,0,C16,0,C16,1,n-7,cis,C18,0,C18,1,n-9,cis,C18,1,n-

9、9,trans,摘自,Modern Nutrition in Health and Disease,第,9,版,第,68,页,1999,年,24,常见的脂肪酸,名,称,亚油酸,1inoleic,acid,亚麻酸,1inolenic,acid,亚麻酸,1inolenic,acid,花生酸,arachidic,acid,花生四烯酸,arachidonic,acid,二十碳五烯酸,timnodonic,acid,EPA,芥子酸,erucic,acid,二,十,二,碳,五,烯,酸,鰶,鱼,酸,(clupanodonic,acid,二,十,二,碳,六,烯,酸,docosahexenoic,acid,DH

10、A,二,十,四,碳,单,烯,酸,神,经,酸,(nervonic,acid,代,号,C18,2,n-6,9,all,cis,C18,3,n-3,6,9,all,cis,C18,3,n-6,9,12,all,cis,C20,0,C20,4,n-6,9,12,15,all,cis,C20,5,n-3,6,9,12,15,all,cis,C22,1,n-9,cis,C22,5,n-3,6,9,12,15,all,cis,C22,6,n-3,6,9,12,15,18,all,cis,C24,1,n-9,cis,25,必需脂肪酸及其功能,必需脂肪酸,essential fatty acid,EFA,是指人

11、体不可缺少而自身又不能合成,必须通过食物供给的脂肪酸,n-6,系列中的亚油酸和,n-3,系列中的,亚麻酸是人体必需的两种脂肪酸,26,必需脂肪酸及其功能,必需脂肪酸功能,1,是磷脂的重要组成成分,2,与精子形成有关,3,是合成前列腺素的前体,4,有利于组织修复,5,与胆固醇的代谢有关,27,脂肪酸,fatty acid,的分类和命名,按碳链长度,按营养角度,长链脂肪酸,14 26C,中链脂肪酸,8,12C,短链脂肪酸,2,6C,从结构,饱和脂肪酸（不含双键,不饱和脂肪酸（含有一个,或多个双键,单不饱和脂肪酸,多不饱和脂肪酸,必需脂肪酸,不饱和,高度,不饱和脂肪酸,亚油酸、亚麻酸和花,生四烯酸,

12、非必需脂肪酸：饱和,低,度不饱和脂肪酸,按其空间结构不同分类,顺式脂肪酸,cis-fatty acid,反式脂肪酸,trans-fatty,acid,28,常规脂肪提取方法,粗脂肪分析方法,Soxhlet,索氏,萃取法,最一般的脂类定量方法,Weibull-Stoldt,法,酸分解法,碳水化合物和蛋白质的影响下脂类提取困难时,其他,Rose Gottlieb,法,氨基酸分解法, Gerber,法,NIR,超声波法,29,常规脂肪提取方法,1. Soxhlet,索氏,萃取法,从,1879,年介绍以至今广范围使用的方法,最广范围使用的脂肪分析法,用,Petroleum ether, diethyl

13、 ether,等低沸点溶液提取样品中的脂肪,提取,干燥,重量差值,确定脂肪含量,分析步骤,样品前处理,干燥,粉碎,Na2SO4,脱水,Cu(OH)2,沉淀,提取,溶液挥发,干燥到适当,确定粗脂肪含量,干燥后重,g),100,样品重,g,30,常规脂肪提取方法,1. Soxhlet,索氏,萃取法的优缺点,优缺点,不需要加水分解节省时间,仪器价格低廉,广范围的应用,蛋白质,碳水化合物含量高时不适用,随溶剂的种类,提取时间的变化结果不同,其他亲水性物质也一块提取,磷脂只能部分提取,需要大量的溶剂,制动化不易,应用分支,一般食品行业,为其他分析而除去脂肪,31,常规脂肪提取方法,2,酸水解,acid

14、hydrolysis,酸水解的必要性,直接用,Soxhlet,索氏,提取法不能把所有的脂肪提取出来,碳水化合物,蛋白质等把脂肪包裹的情况,植物细胞或,starch-membrane,淀粉膜,中掺杂的情况,非溶性胶质把脂肪包裹的情况,牛奶,乳酪,奶油,乳制品,谷类,面包,蛋类,鱼类,肉类,豆腐,原理,试样经酸水解后用乙醚提取，除去溶剂即得总脂肪含量。酸水解法测得的为,游离及结合脂肪的总量,酸分解过程,加入,4M HCl,时样品的,matrix,成分分解,过滤后脂肪分离,用热水洗涤,干燥,之后提取,干燥后测量重量变化计算脂肪含量,32,常规脂肪提取方法,3,其他,fat,分析方法,Phospho-

15、, di-, monoglyceride,磷脂、甘油二酯、甘油单酯,比起一般只有三个脂肪酸的甘,油三酯具有低的热量,各脂肪含有磷脂,Phosphatide,的混合物时磷脂可以分离为脂肪但是在提取过程中会有部,分的损失因此完美的提取很困难,原理,试样经酸水解后用乙醚提取，除去溶剂即得总脂肪含量。酸水解法测得的为游离及结合脂,肪的,总量,用高沸点的溶剂提取,KOH,加入酸溶液,转换为脂肪酸,决定,脂肪,含量,33,脂肪酸提取方法,原理,为了脂肪样品的气象色谱分析,首先要分离为单一的脂肪酸状,态,脂肪,或者脂类,不溶于水但是溶于有机溶剂的特性的物质,大,概分为单纯脂肪,Triglycerides,

16、diglycerides, monoglycerides,free fatty acids cholesterol esters, cholesterol and waxes,esters,和极性或者复合脂肪,磷脂及糖脂,脂肪可以通过多种有机溶剂从组织中提取但是对于组织的酶类,和非活性化的脂肪要完全提取出需要注意,34,脂肪酸提取方法,具有细胞壁的复合脂肪具有,hydrogen bond,或,hydrophobic forces,及,ionic bond,的蛋白质及碳水化合物的细胞内的其他化合物连接,因此不容,易提取,从组织中提取脂肪需要用像,chloroform,氯仿,一样可以溶解脂肪还可以

17、,与,methanol,一起把脂肪和组织之间的,matrix,之间的相互作用给分解的溶,剂,糖,sugars,氨基酸及盐,salts,等,non-lipid contaminants,需要通过,washing procedure,从提取物中剔除掉,这样的方法可以参考,Folch, Lees,及,Stanley(1957,的建议,35,脂肪酸提取方法,方法,用,chloroform-methanol( 2:1, v/v,把提取物进行摇荡后加入占,体积的,saline,solution(0.88% in water,进行平衡,这时混合物分成,2,个层,下层为氯仿层包含所有脂肪,上层为,methan

18、ol-water,phase,包含,non-lipid contaminants,2,脂肪提取,样品,flax seed,亚麻籽, margarine,人造黄油, ground beef, Blank,不含所测物质,试剂,1) Folch solution: chloroform: methanol (2:1, V/V,2) 0.88% NaCl,提取步骤,1,准确称取,1.0g ground beef, 0.2g,的,flax seed,或,0.1g,的,margarine,放入,50ml,Teflon lined screw cap tube,后加入,20ml,的,Folch soluti

19、on,36,脂肪酸提取方法,2) Homogenizing,3,拧紧盖子并在,在室温,12h,摇晃,必要时加入,N,2,4,加入,4ml,的,0.88% NaCl,并充分混合,5,1500rpm,4,10min centrifuge,6,分,2,层,记下,Chlorform,层的体积，并把上层,methane+water,吸取掉，下层则包含所要,提取的脂肪,这样分离的脂肪用于分析如下,a,Total crude lipid analysis,b,Fatty acid analysis,c,Lipid class separation by TLC and their fatty acid co

20、mpostion,d,Lipid class quantitation,by,Iatroscan,37,脂肪酸提取方法,A. Total Crude Lipid analysis,a,把下层即,chloroform,层用吸管移入到,glass vial,b,在加入,N,2,gas,的情况下挥发溶剂,chloroform,要充分挥发后承重,c,计算,lipid, wt,blank) X total chloform voloum, lipid,Aliquant of chloform X wt. sample,X 100,B,脂肪酸,fatty acid,分析,通过气象色谱仪识别波峰并且利用面积

21、,计算样品中脂肪酸的成分,理论,利用,GC,分析脂肪的脂肪酸成分需要把脂肪酸进行甲酯化,methyl ester,转换,成低分子亮的非极性,non-polar,诱导体,为了把样品变成挥发性变成诱导体可以增加安全性,减少活性,变化成可分理,性改善测定效率,根据这个原理可以改善波峰的色谱性,38,脂肪酸提取方法,Methyl ester,甲酯化,方法,Fatt,y Acids,Met,hylester,Esterification,O,Methyl ester,O,R C OH CH,Acid,3,OH H,HCl,2,SO,or,4,R C O CH,3,H,Free fatty acid,Me

22、thanol,BF,2,O,3,Reflux,Volatile in Gas,Transesterification,Chromat,ography,O,CH,2,O C R,Methyl ester,Glyceride,O,CH,3,ONa,O,mixture,CH O C R,CH,3,OH,3,R C O CH,3,O,Methanol,Volatile in Gas,Chromat,ography,CH,2,O C R,BF,hexane) 2ml,3,methanol mixture(35% BF,3,methanol(14%)+ 45% methanol + 20,Glycerol

23、,C-OH,C-OH,C-OH,39,脂肪酸提取方法,Methyl ester,甲酯化,步骤,1,加入,N,2,gas,把,Chloroform,层挥发,5060,2,加入,hexane) 2ml,BF,3,methanol mixture(35% BF,并加入,N,后拧紧盖子,3,methanol(14%)+ 45% methanol + 20,2,gas,vortexing,3,在,100,加热,3060min,隔,15min,进行,shaking( vortexing,4,室温静置,加入,12ml,hexane,己烷,和,1ml 0.88% NaCl,混合,5,离心,6,取上层液转入小玻

24、璃瓶盖上盖子,7,GC,分析,40,41,42,饲料中脂肪酸分析,The Agilent 7890A Gas Chromatograph,43,44,饲料中脂肪酸分析,45,饲料中脂肪酸分析,Gas Chromatography,Filters/Traps,Data system,H,RESET,Regulators,Syringe/Sampler,Inlets,Detectors,Column,gas system,inlet,column,detector,data system,46,Gas Carrier,Hydrogen,Air,饲料中脂肪酸分析,Gas Chromatography

25、,原理示意图,47,饲料中脂肪酸分析,48,49,饲料中脂肪酸分析,GC,探测器,燃烧性探测器,1)Flame Ionization Detectors(FID,2)Nitrogen Phosphorous Detector(NPD,3)Flame Photometric Detector(FPD,非燃烧性探测器,4)Thermal Conductivity Detector(TCD,5)Electron Capture Detector(ECD,6)Photo Ionization Detector (PID,注意事项,燃烧性探测器,FID, NPD, FPD,使用,3,种气体,补充气体,m

26、ake-up gas,氢气,空气,非燃烧性探测器,TCD, ECD, PID,只是使用运送气体和补充气体,50,Flame Ionization Detector (FID, Column effluent is passed through a,H,2,Air,flame,Produces,ions,and,electrons, Charged particles are accelerated by voltage,applied between,jet,and,collector,results in current (pA, Number of,ions,depends on number of,reduced,methylene,carbons,in molecule,one molecule of ethane gives tw