控制性低中心静脉压对兔肝缺血再灌注损伤保护作用的研究

1、控制性低中心静脉压对兔肝缺血再灌注损伤保护作用的研究重庆医科大学附属第一医院麻醉科 400016邓圻玮希 闵苏 何开华 程波【摘要】 目的 研究控制性低中心静脉压（CLCVP）对肝缺血再灌注损伤（IRI）后肝脏血流速度、生化及肝脏超微结构的变化，了解其肝保护作用。方法 新西兰大白兔32只，随机分为4组：对照组（C组）、单纯CLCVP组（L组）、肝IRI组（IR组）、CLCVP下肝IRI组（LIR组）。麻醉后，L组建立CLCVP模型（CVP 4-5 cmH2O, MAP90 mmHg），IR组建立肝IRI模型(夹闭肝门1/2 h后开放)，LIR组建立CLCVP模型和肝IRI模型。分别于各组处理前

2、(T0)、CLCVP模型建立(肝IRI血流开放)即刻(T1)、1/2 h(T2)、1 h(T3)、2 h(T4)、4 h(T5)、6 h(T6)时点，彩色超声测肝血流速度，抽静脉血检测ALT、AST。各组取肝组织固定，电镜观察细胞超微结构变化。结果 1、与C组比， L组各时点间肝脏动静脉流速差异无统计学意义，IR组T1-5时点肝动脉流速减慢(P0.05)，IR组T5、6时点及LIR组T1-6时点肝静脉流速增快(P0.05)；与IR组比，LIR组T1、2时点肝动脉流速增快(P0.05)，LIR组T1-6时点肝静脉流速增快(P0.05)。2、L组各时点AST和ALT较C组差异无统计学意义。IR 组

3、和LIR组T1-6时点AST、ALT较C组和L组增高(P0.05)；IR组T1、T4-6时点ALT和AST值均高于LIR组(P0.05)。3、C组和L组超微结构未见异常。LIR组较IR组肝细胞线粒体肿胀减轻，血窦面微绒毛稍有肿胀，肝血窦覆盖完整。结论 CLCVP对肝IRI有一定保护作用，其机制可能与改善肝IRI后肝血流情况，减轻肝细胞及肝血窦损伤，改善器官灌注有关。【关键词】控制性，中心静脉压；缺血再灌注；肝保护；血流速度Study of protection of controlled low central venous pressure to hepatic ischemia reper

4、fusion injury in rabbitsDENG Qi-wei-xi, MIN Su, HE Kai-hua, et al. Department of Anesthesiology, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, ChinaCorresponding author: MIN Su (E-mail: )Abstract Objective To investigate the effect of controlle

5、d low central venous pressure (CLCVP) on blood flow velocity，biochemical indicators and ultramicrostructure of rabbit liver after hepatic ischemia reperfusion injury (IRI) . Methods Thirty-two healthy New Zealand white rabbits of both sexes were randomly divided into 4 groups(n=8 each): groupcontrol

6、 (C), group CLCVP with no IRI(L); group IRI (IR); group CLCVP+IRI (LIR). The animals were anesthetized with 3% pentobarbital 30 mg/kg through ear marginal vein, intubated and mechanically ventilated. In group L and LIR nitroglycerin 10-30 gkg-1min-1 and dopamine 40-50 gkg-1min-1 were pumping via fem

7、oral vein to establish the CLCVP rabbits model (CVP 4-5cmH2O, MAP 90mmHg).In group IR and LIR hepatic IRI model was produced by occluding porter vein and hepatic artery for 30 minutes followed by reperfusion. The contents of serum ALT, AST and blood flow velocity of hepatic artery and vein were meas

8、ured after anesthesia(T0) and at immediately(T1), 1/2 h (T2), 1 h (T3), 2 h (T4), 4 h (T5), 6 h (T6) after CLCVP modeling or IRI reperfusion. Ultramicrostructure of liver was observed by transmission electronic microscope(TEM) after 6h reperfusion. Results There was no significant difference in bloo

9、d flow velocity of hepatic and the serum AST and ALT between group C and L. Blood flow velocity of hepatic artery was significantly slower at T1-5 in group IR than in group C, and significantly faster at T1-2 in group LIR than in group IR. Blood flow velocity of hepatic vein was significantly faster

10、 at T5-6 in group IR and T1-6 in group LIR than in group C, and was significant faster at T1-6 in group LIR than in group IR. The serum ALT and AST concentration was significantly higher at T1-6 in group IR and LIR than in group C and L, and there was no significantly difference between group C and

11、L. The serum ALT and AST concentration was significant higher at T1,T4-6 in group IR than in group LIR. The damage to liver tissue was significantly ameliorated in group LIR. Conclusion Controlled low central venous pressure can attenuate hepatic ischemia reperfusion injury. 【Key word】 controlled；ce

12、ntral venous pressure；liver function；ischemia reperfusion injury； blood flow velocity控制性低中心静脉压(Controlled low central venous pressure, CLCVP)指通过麻醉及其它医疗手段将CVP 控制在35 cmH2O，同时维持动脉收缩压 90 mmHg和心率稳定，以减少术中出血。肝脏手术术中大量出血和肝缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury，IRI)是术后并发症和死亡的主要原因。有研究1、2证实CLCVP技术应用于肝脏手术能有效地减少术中出血

13、和血制品的输注，缩短手术时间，但其血流动力学改变对肝脏及其他重要脏器的灌注是否有影响尚存在争议3。因此，本研究拟探讨该技术对肝IRI后肝血流速度变化、肝功能以及肝超微结构的影响，对其在肝脏手术中的临床应用提供参考。材料与方法小动物呼吸机(TKR-200A型，南昌特力麻醉呼吸设备公司)，双通道微量注射泵(WZS-50F6，浙江大学医用仪器有限公司)，BL-410生物机能实验系统（成都泰盟科技有限责任公司），彩色超声多普勒诊断仪 (GE V730，美国通用电气公司)，752紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），电镜（H-7500，Hitachi，日本），谷草转氨酶（GOT/AST）比色法

14、试剂盒（长春汇力生物技术有限公司），谷丙转氨酶（GPT/ALT）比色法试剂盒（长春汇力生物技术有限公司）成年新西兰大白兔32只(重庆医科大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重1.9-2.2kg。随机分为4组（n=8）：对照组（C组）、单纯CLCVP组（L组）、肝IRI组（IR组）、CLCVP下肝IRI组（LIR组）。耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，仰卧固定于兔台。气管切开接小动物呼吸机机械通气；分离右颈内静脉和左颈总动脉，插管监测CVP、MAP；分离右股静脉置管。L组、LIR组建立LCVP模型：泵入硝酸甘油10-30 gkg-1min-1、多巴胺30-40 gkg-1min-1

15、，将CVP降至4-5 cmH2O，并维持MAP 90 mmHg。IR组、LIR组建立IRI模型：脱毛，逐层入腹，用无创动脉夹夹闭肝门，阻断血流1/2 h后开放。在各组处理前(T0)、LCVP模型建立(IRI血流开放)即刻(T1)、1/2 h(T2)、1 h(T3)、2 h(T4)、4 h(T5)、6 h(T6)各时点，彩色超声测门静脉、肝静脉、肝动脉血流速度，抽血检测ALT、AST。6 h后取肝脏，快速制备数个111 mm大小组织块，置于4 4%戊二醛中固定，常规透射电镜制样，观察肝细胞超微结构。应用SAS8.2统计软件分析处理数据，计量资料用均数标准差(s）表示，采用重复测量数据方差分析，P

16、0.05为差异有统计学意义。结 果 与C组比， L组各时点间肝脏动静脉流速差异无统计学意义，IR组T1-5时点肝动脉流速减慢(P0.05)，IR组T5、6时点及LIR组T1-6时点肝静脉流速增快(P0.05)；与IR组比，LIR组T1、2时点肝动脉流速增快(P0.05)，LIR组T1-6时点肝静脉流速增快(P0.05,表2 各组各时点肝静脉血流速度的比较(n=8，cm/s，s)分组T0T1T2T3T4T5T6C组7.731.348.262.167.754.178.483.208.982.749.483.328.951.22L组9.031.1315.887.6714.105.3712.904.0

17、714.395.1015.652.6513.234.82IR组10.081.785.693.607.432.6910.404.7111.833.6822.7316.05*20.0012.33*LIR组10.181.4927.0813.89*#32.2517.46*#35.0510.00*#38.757.14*#34.258.26*#33.509.95*#与C组比，*P0.05, 与L组比，#P0.05, 与IR组比，P0.05表3 各组各时点肝动脉血流速度的比较(n=8，cm/s，s)分组T0T1T2T3T4T5T6C组46.355.9951.2016.3048.156.0249.6315.3

18、250.438.1553.454.3355.838.87L组45.205.3048.8012.7434.6816.3636.586.4342.3813.1643.9316.9842.565.21IR组44.932.2720.2810.86*23.7314.33*29.5811.90*31.4813.94*21.052.02*43.7012.17LIR组42.786.9744.1310.9642.5810.9533.1313.9234.4011.1230.4717.0346.253.20与C组比，*P0.05, 与L组比，#P0.05, 与IR组比，P0.05L组各时点AST和ALT较C组差异无

19、统计学意义。IR 组和LIR组T1-6时点AST、ALT较C组和L组增高(P0.05)；IR组T1、T4-6时点ALT和AST值均高于LIR组(P0.05),见表4、5，图1、2。表4 各组各时点AST活性的比较(n=8，U/L，s)分组T0T1T2T3T4T5T6C组27.504.4722.001.8523.887.3024.502.3323.506.0226.883.2731.502.45L组25.636.0532.8810.4932.1310.4133.756.6335.5011.5129.505.3233.505.32IR组31.255.2681.7515.36*#98.3815.58

20、*#111.5013.06*#125.2511.21*#130.3818.68*#107.1315.94*#LIR组30.135.0052.006.55*#72.7510.02*#83.254.62*#84.7516.59*#66.1316.92*#71.5016.72*#与C组比，*P0.05, 与L组比，#P0.05, 与IR组比，P0.05表5 各组各时点ALT活性的比较(n=8，U/L，s)分组T0T1T2T3T4T5T6C组25.883.8023.505.8328.881.9626.503.1224.634.6029.884.6730.636.89L组23.882.4229.002.

21、8828.136.9029.634.9631.634.6631.634.6632.507.03IR组30.134.8561.259.00*#73.388.38*#81.257.61*#97.136.33*#111.635.34*#98.755.85*#LIR组30.384.9049.005.24*#64.1311.93*#73.7511.67*#62.254.50*#64.004.04*#57.254.59*#与C组比，*P0.05, 与L组比，#P0.05, 与IR组比，P0.05图1 各组AST活性的变化情况(n=8，cm/s，s)与C组比，*P0.05, 与L组比，#P0.05, 与IR

22、组比，P0.05图2 各组ALT活性的变化情况(n=8，cm/s，s)与C组比，*P0.05, 与L组比，#P0.05, 与IR组比，P0.05C组和L组超微结构未见异常。IR组肝细胞线粒体明显肿胀、嵴断裂，滑面内质网增生明显，血窦面微绒毛明显肿胀，可见空泡状，有脱落入肝血窦腔内，肝血窦窦壁破坏明显，肝血窦腔内可见中性粒细胞、淋巴细胞浸润。LIR组线粒体稍有肿胀，无嵴断裂，滑面内质网增生明显，血窦面微绒毛稍有肿胀，肝血窦窦壁覆盖完整。讨 论既往LCVP技术多重视CVP的降低，对MAP的维持关注不够。本研究将CVP降低的同时，控制MAP于正常范围下限，即CLCVP技术，以改善器官灌注。在临床上，

23、CLCVP技术多以限制输液、血管活性药物、降低潮气量相结合的方式实现。由于小动物血容量较少，液体的输注对血流动力学影响大，因此，本研究采用加深麻醉、机械通气辅助呼吸、高浓度小剂量输注血管活性药物相结合的方式建立本动物模型，降低CVP，同时维持MAP 90 mmHg。本研究显示C组与L组相比肝脏各血管血流速度、ALT、AST差异无统计学意义，且L组超微结构未见异常，提示CLCVP技术对正常肝组织无明显损害。本研究中IR组再灌注后早期肝动脉血流速度明显降低，肝门静脉、肝静脉流速较C组无明显差异，即肝血窦血液淤滞，这与已有研究相一致：肝组织缺血缺氧损伤血窦内皮，表面受体暴露，粘附、聚集血小板、粒细胞

24、4；再灌注时受损的内皮细胞产生大量内皮素，使微血管强烈收缩5；内皮细胞肿胀坏死脱落、中性粒细胞的粘附聚集、微血栓的形成造成微循环障碍6，使肝组织内血液淤滞。而后肝动、静脉流速逐渐增快，肝动脉于T6时点恢复正常流速，肝静脉于T5时点流速快于C组，即IRI再灌注后肝淤血，微循环障碍明显，其后血液流速逐渐恢复，肝脏微循环情况逐渐好转。LIR组再灌注后早期肝静脉流速较对照组增快，肝动脉血流速度较IR组速度增快，提示CLCVP技术使肝脏血流在压力较低的情况下维持较快的速度，减轻再灌注后肝脏微循环障碍，使肝脏内淤滞血液迅速进入体循环，改善肝IRI灌注。再灌注后IR组、LIR组ALT、AST值逐渐增高，IR

25、组于T5时点达最大值，LIR组于T3时点达最大值，其中，LIR组T1、T4-6时点ALT、AST值均较IR组低；电镜结果也证实，LIR组与IR组相比肝血窦内皮细胞及肝细胞损伤程度明显减轻。提示肝再灌注对IR组和LIR组肝组织均造成了损伤，LIR组CLCVP技术减轻肝缺血缺氧损伤，并使肝组织再灌注后较快的恢复。其机制可能是：CLCVP技术使血液快速经过肝脏血窦，使各种炎症因子更快进入体循环，降低肝脏局部炎症因子浓度，减轻对肝细胞和肝血窦内皮细胞的损害，同时使富含氧气和营养的血液更快流入肝组织，满足肝组织局部血氧需求，促进肝脏的损失修复。 综上所述，CLCVP技术对正常肝组织无明显损害，对肝缺血再灌注损伤有一定保护作用，其保护机制可能与改善肝IRI后肝血流情况，减轻肝细胞及肝血窦损伤，改善器官灌注有关。参 考 文 献1. Massicotte L，Lenis S，Thibeault L，et al. Effect of low central venous pressure and phlebotomy on blood product transfusion requirements during liver transplantation. Liver transplantation，2006，Jan，12：117-123.2