总RNA的提取和检测实验报告

1、总 rna的提取和检测实验报告实验二总 rna 的提取与检测实验目的1、掌握从动物组织细胞中提取总rna 的方法 ;2、熟悉紫外吸收法检测rna 浓度与纯度的原理及测定方法;3、掌握 rna 琼脂糖凝胶电泳方法并分析总rna 的电泳图谱 ;实验原理(一)概述-51、 10g rna/ 细胞含有 rrna 80-85%:28s 18s 5strna, snrna 10-15%2、 mrna 3端存在 20-250 个多聚腺苷酸 (polya) 结构 ,可用 oligo(dt) 亲与层析柱分离 mrna 。3、rna 分离的方法 :异硫氰酸胍氯化铯超速离心法 ,盐酸胍 -有机溶剂法 ,氯化锂 -

2、尿素法 ,蛋白酶 k-细胞质 rna 提取法、异硫氰酸胍 -酚-氯仿一步法等。4、目前常用的就是trizol 法。(二)trizol 的主要成分1、trizol 就是一种新型总rna 抽提试剂 ,主要成分就是异硫氰酸胍与苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂,就是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质 ,其主要作用就是裂解细胞 ,使细胞中的蛋白 /核酸物质解聚得到释放。2、酚虽可有效的变性蛋白质 ,但就是它不能完全抑制 rna 酶活性 ,因此 trizol 中还加入了 8-羟基喹啉、 -巯基乙醇等来抑制内源与外源 rnase。3、溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相与有机相,rna 在上层水相中。4

3、、取出水相用异丙醇沉淀可回收rna; 用乙醇沉淀中间层可回收dna 。( 三) 总 rna的纯度检测原理 :不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收, 光能量被吸收的程度与物质的浓度有一定的比例关系。rna在 260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。因此 , 可以用 260nm波长分光测定 rna浓度 ,od 值为 1 相当于大约 40g/ml总 rna的提取和检测实验报告的单链 rna。用 ph=7、6 的 te(tris hcl 缓冲液 ) 稀释 rna样品 n 倍并以 te 为空白对照 , 根据此时读出的 od 260 值即可计算出样品稀释前的浓度 : rna (mg/ml

4、) = 40 od 260 读数稀释倍数 (n)/1000实验步骤(一)样品处理与 trizol 用量1、提取组织 rna 时,每 50 100mg 组织 (即 0、50、50、5cm,约合 0、1cm3)用 1ml trizol 试剂对组织进行裂解 ;2、悬浮细胞先离心沉淀 ,每 5-10106 个细胞加 1ml trizol 后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。3、培养贴壁细胞不须消化 ,可直接用 trizol 进行消化、裂解 ,trizol 体积按 10cm2/ml 比例加入。 (注意 :匀浆一定要彻底 ,就是提取高质量 rna 的前提 ;细胞数量与 trizol 的比例 ,细胞的数量

5、不能过多。 )(二)操作步骤1、细胞中加入 1 mltrizol 用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后 ,室温放置 5min,使其充分裂解。 (注意 :此时可放入 -70长期保持 )2、按 200 l 氯仿 /ml trizol 加入氯仿 ,振荡混匀后室温放置2-3min。(注意 :此步一定要振荡混匀 ,使氯仿与 trizol 不分层 )3、 4 12,000g离心 5-10min。样品分为三层 :底层为黄色 (红或绿 )有机相 ,上层为无色水相与一个中间层。 rna 主要在水相中 ,水相体积约为所用 trizol 试剂的60。4、吸取上层水相 ,至另一新的离心管中。一般400-450l 就足够了

6、,千万不要贪多！ (注 :千万不要吸取中间界面 )5、加入与水相等体积异丙醇后,上下颠倒混匀 ,4放置 5 min。7、412,000g 离心 10 min,弃上清 ,离心后在管侧与管底出现胶状沉淀。8、加入 1 ml 75%乙醇 ,(在沉淀对面管壁加入 ,切勿触及沉淀！ )盖紧盖子后 ,温与转离心管 1 周,充分润洗管壁。9、412,000g 离心 5 min,尽量弃上清。10、室温晾干或真空干燥5 min。(注 :rna 样品不要过于干燥 ,否则很难溶解 )11、加入适量冰冷无 rnase 的 pepc 水(一般 10 -20l), 充分震荡混匀 ,瞬时离心 ,总 rna的提取和检测实验报告备用。(三)检测步骤1、将提取的 rna, 按 1:20 加入 te 进行稀释2、稀释过后用分光光度仪进行检测,先使用 te 行进校对 ,空白对照 ,所有样品要先润洗三次之后 ,再加入 50l 样液进行检测3