实验教程细胞染色.ppt

1、试剂染色培训,影响信号定量分析的因素 细胞的荧光染色：细胞对荧光染料分子的亲合性相对一致、细胞结合的荧光分子量、染色的浓度、时间、温度、pH值、细胞数等。 激光光源的稳定性。 细胞流速的稳定性。 细胞悬液样品的质量：细胞粘连、重叠、杂质过多等,应用流式细胞术的基本步骤 首先制备出合格的单细胞悬液。 对感兴趣的细胞生物化学成分进行特殊染色。 上机测量，采集数据。 对收集、储存的数据进行定性、定量分析。 从生物医学方面对分析结果予以解释,制备合格的单细胞悬液,标本来源：骨髓、外周血、脑脊液 或淋巴组织穿刺及活检组织。 处理：肝素抗凝，不超过48小时，检测前常规记数和形态学检查。目前一般都直接用全血

2、标记，近可能减少冷冻、离心等有可能损伤细胞的步骤。组织标本研磨后必须过滤。 数量：5*105-2*106细胞；再根据染色目的决定体积,贴壁细胞或组织,贴壁细胞： 胰蛋白酶消化 离心 PBS重悬 组织： 胰蛋白酶消化或胶原酶处理或研磨法处理 洗涤 离心 重悬 注意：贴壁细胞或组织来源细胞制备时必须过滤（使用尼龙网或目以上组织筛）,细胞膜染色,加入需要染色的抗体 加入抗凝血100ul或调整好浓度的细胞悬液，混匀，室温避光15min-30min 加入红细胞裂解液，混匀室温，5-10min。 加入与红细胞裂解液等量的PBS。混匀，5min,细胞内染色,按细胞膜染色方法染膜表面抗体 加入PBS洗涤 细胞

3、悬液离心后留沉淀 加入固定剂固定A 加入破膜剂B 加入胞内抗体，室温20-30min 加入PBS洗涤 加入PBS重悬,固定剂：乙醇，4% 多聚甲醛，甲醇等 破膜剂：乙醇，tritonX-100，皂素，甲醇等 对于细胞比较少的细胞样品：使用商品化的固定破膜剂,标 记 和 检 测,根据临床初步印象或研究目的，选择检测哪些指标？ 选择抗体 选择荧光素 标记 上机检测获得最佳结果,常用的标记单克隆抗体的荧光素,488nm激光激发： FITC（异硫氰酸荧光素）： 荧光强度可受pH的影响，当pH降低时其荧光强度也随之减弱 PE（藻红蛋白） PerCP（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好应用在检测

4、表达较高的抗原上 PerCP-Cy5.5（叶绿素蛋白偶联物） PE-Cy7（藻红蛋白偶联物） PE-Cy5（藻红蛋白偶联物，又称Cy-Chrome） PE-Texas Red（藻红蛋白-德州红偶联物，又称ECD） 633nm激光激发： APC（别藻青蛋白） APC-Cy7（别藻青蛋白偶联物,Fluorescence Spectrum Viewer,FITC,Fluorescence Spectrum Viewer,PE,Fluorescence Spectrum Viewer,PE-Cy5,Fluorescence Spectrum Viewer,PE-Cy7,Fluorescence Spe

5、ctrum Viewer,PerCP,Fluorescence Spectrum Viewer,APC,Fluorescence Spectrum Viewer,PI,Fluorescence Spectrum Viewer,EGFP,Fluorescence Spectrum Viewer,FITC和EGFP能否一起使用,荧光染料比较(平均荧光强度) Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统,PerCP APC FITC ECD PC5 PE,CD8-FITC,CD8-PE,CD8-ECD,CD8-PC5,CD8-PerCP,CD8-APC,PerCP APC FITC ECD PC

6、7 PC5 PE,Dye Intensity Comparisons,Data generated on EPICS Altra on a single donor,PC7 Dye Performance,CD8-PC7 (FC500 or FACSCalibur,CD8-PC7 (XL,FC500-单激光五色的荧光光谱示意图,常用的核酸荧光标记探针,PI（碘化丙啶）：可嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中，主要用于对DNA染色，使用时需用RNase对细胞进行处理；不能透过活细胞膜对核酸染色，可用于鉴别活死细胞，对活细胞染色时需对细胞膜打孔，以便染料透过。488nm激光激发，发射光谱宽泛

7、550725nm，在贝克曼的流式细胞仪上使用ECD荧光素通道。 TO（噻唑橙）：可用于对网织红细胞中的RNA进行检测定量分析，TO的荧光强度与RNA含量由良好的线性关系，对细胞膜的通透性好，可直接对活细胞染色，488nm激发，可发射出530nm荧光，使用FITC荧光素通道,常用荧光素激发、发射、滤光片波长,常用荧光染料组合,FITCPE：最常用的双色组合 FITCPEPE-Cy5：最常用的三色组合，进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小 FITCPEECD+PE-Cy5:最常用的四色组合 FITCPEECD+PE-Cy5+PE-Cy7：而且PE-Cy7与FITC、PE、PE-Cy5标记的抗体一

8、同使用时的荧光补偿小 PE-Cy5可与FITC、PE同时使用，但不能与APC同时使用，二者之间荧光干扰太大,已有的激光器的发射波长 已有的光电倍增管 抗原表达的强弱 荧光素与待检目标是否有非特异性结合 多色搭配 检测的目的 可靠公司来源,荧光素的选择,流式抗体的选择搭配及对照的设定,CD分子,CD（cluster of differentiation）分子 目前已不仅仅专指白细胞分化抗原，还有红细胞膜表面抗原，血小板表面抗原，髓系细胞表面抗原及其他组织细胞表面或细胞内的抗原等，是细胞分化成为不同谱系（lineage）、不同阶段以及活化过程中或疾病状态下出现或消失的抗原标记，或上述抗原识别的抗体

9、 CD命名方法 识别同一抗原2种以上的单克隆抗体作为一个抗体群，每一抗体群以CD后面加上数字来表示，如CD3，CD20等 相同CD上存在着不同的抗原决定簇且可被特定的单克隆抗体识别时，在CD数字后面加上小写字母用以区分，如CD1可细分为CD1a、CD1b、CD1c及CD1d；CD49又分成CD49a-f 在CD数字后带有大写字母“R”时，指该CD仅发现于某特定类型的细胞上，如CD45是白细胞共同抗原，而CD45R是仅发现于单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞及部分T淋巴细胞的膜抗原 非CD类抗原 常结合CD分子进行检测，有助于一些疾病的发病机制研究及诊断、治疗等,抗体(Antibody,抗体的种类及

10、选择的原则,单克隆抗体 混合单克隆抗体 多克隆抗体,荧光直标的抗体 未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进行间接标记检测,单分子荧光素 复合分子荧光素,选择可靠公司的高质量的产品，事半功倍,由一株B细胞杂交瘤增生而成的单一克隆细胞所产生的一种高度均一, 高度专一性的抗体.(Monoclonal Antibody, McAb). 1975年, Koehlerz 和Milstein首次应用细胞融合技术将小鼠免疫脾(B)细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 形成杂交瘤细胞.这种杂交瘤细胞既保持了骨髓瘤细胞大量无限增生的特性, 又继承了免疫B细胞合成分泌某种特异性抗体的能力. 应用该技术, 即可得到均一化学结构和单

11、一特异性的抗体分子, 成为单克隆抗体, 简称单抗. 每种单抗只识别某一特定的抗原决定簇, 具有高度特异性. 目前生产的单抗以动物源性为主. 单抗种类:纯净品 荧光抗体(将单抗与不同荧光染料结合) 生物素化抗体(单抗与生物素结合,单克隆抗体,Mouse anti-Human CD3-FITC Clone:UCHT1 Isotype:IgG1 Mouse Mouse: 抗体来源-小鼠 Anti-Human: 检测对象为人类细胞 CD3-FITC: 检测CD3的抗原, 该抗体为FITC荧光素标记 UCHT1:抗体的Clone 株 IgG1 Mouse: 为抗体的免疫球蛋白亚型,所以选用的阴 性对照应

12、为Mouse IgG1-FITC,如何读懂荧光标记的单克隆抗体,荧光抗体组合的选择和搭配1,用不同颜色的荧光素标记不同种类的单克隆抗体，可以在一个细胞上同时分析多种抗原分子，但并非各种荧光抗体均可以自由地组合在一起，在确定组合选择之前，还必须考虑到一些影响因素 1. 流式细胞仪的类型及荧光光谱 选择适当强度的光源作为荧光物质的激发光源，并选择适合于被检荧光物质选择性吸收的光谱滤光片接收荧光 2. 了解不同抗体的细胞反应谱，以及染色模式 根据不同的实验目的选择抗体。因为相同CD编号的抗体可能识别不同的抗原决定簇。如CD45RA表达在幼稚/静止T淋巴细胞，而CD45RO表达在记忆/活化T淋巴细胞。

13、 胞膜和胞内染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最后是DNA染色,荧光抗体组合的选择和搭配 2,3. 抗体结合荧光素的荧光强度 每一种荧光素的相对荧光强度都不一样。一个特定抗体，能否区分阴性与阳性结果，即有较好的S/N比值，取决于该抗体用何种荧光素标记。 荧光素相对强度也与仪器有关，这是由于不同仪器使用的激光和滤光片组合不同，因此造成了荧光强度的差别。 4. 抗原密度 高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原（如细胞因子）则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE,PE-Cy5,APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的,荧光抗体组合的选

14、择和搭配 3,5. 荧光光谱之间的重叠 在多色分析中，虽然可以通过荧光补偿消除荧光光谱重叠的影响，但使用荧光探针的种类越多，补偿的复杂程度增加，因此选择光谱重叠越少的组合越好 6. 自发荧光 每个细胞群体的自发荧光水平都不同，自发荧光在高波长范围里（600nm）迅速降低。因此检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如PE-Cy5/ PE-Cy7），可得到较好的S/N比 7. 荧光素浓度、配伍不当、试剂的质量均导致假阴性/ 假阳性结果 一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司，有不同的浓度、不同的亚型，可能均需要自身的同型对照，而实际上，这是非常困难的。尽量选择同一家公司的试剂可

15、以减少干扰,流式细胞仪检测最重要的两个要素,电压 信号转换模式，信号传输模式和工具 补偿 过时的相邻相减法，最全面的全矩阵补偿法，最先进的正反全矩阵补偿法，离线补偿法,怎样上机检测获得最佳、准确的数据,荧光染色对照的设置,阳性对照 使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素 阴性对照 空白对照（自发荧光） 电压的调节 自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高，自发荧光越强。 实验样本（自发荧光特异荧光

16、非特异荧光） 特异荧光，即抗体F(ab)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 同型对照（自发荧光非特异荧光） 阳性区域的界定,同型对照的选择,同型对照（Isotype Control） ： 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度 用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色 例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照

17、应选用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1(1) -FITC和IgG2a( 2a)- PE,荧光染色对照的设置,补偿对照（双色或多色分析时） 荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号 将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色 几色分析就需要制备几个补偿对照管,双色荧 光补偿1,双色荧 光补偿2,评定补偿质量的手段,通过调整在象限荧光点图中与阴性细胞群有关的阳性细胞群的位置来达到. 当补偿正确时, 阳性细胞群应与阴性细胞群处在同一水平或垂直线

18、上. 同一水平时, 阴阳细胞群y坐标的中间值应很接近; 在同一垂直线上时, x坐标的中间值应很接近. 验证: 将单色染色得到的百分数与多色染色得到的百分数相比较, 二值应接近, 如果不一致, 则可能颜色补偿不正确, 或抗体搭配不恰当,各种对照的设立,IFNg TNFa IL-4,CD69-PC5,CD69-PC5,IFNg-PE,TNFa-PE,10.6,8.2,2.4,16.6,IFNg-PE,TNFa-PE,Analysis of cytokine production in activated T cells,IL-4,IL-4,CD69-PC5,0.18,0.55,细胞内细胞因子分析SEB/CD28 Activated T cells,流式细胞仪检测可溶性细胞因子(BBA/CBA,一个样本同时定量10种细胞因子 单个细胞因子可以自