方法学验证方案

1、 *含量测定 方法学确认方案 月1年2016日期：验证方案审查与批准 您下面的签字表明您已审阅此份验证方案并同意实施。 姓 名 职 务 签 名 日 期 起草人 签 日职名姓 务 期 名 审核人 审核人 签 职务名 姓 名 日期 批准人 目 录 1. 目的 . 错误!未定义书签。 2. 范围 . 错误!未定义书签。 3. 验证机构与职责 . 错误!未定义书签。 4. 定义 . 错误!未定义书签。 5. 参考文件 . 错误!未定义书签。 6. 风险因素分析 . 错误!未定义书签。 7. 验证准备 . 错误!未定义书签。 8. 检测方法的描述 . 错误!未定义书签。 9. 验证实施 . 错误!未定义

2、书签。 10. 偏差与变更 . 错误!未定义书签。 11. 确认结果评定与结论 . 错误!未定义书签。 12. 确认周期 . 错误!未定义书签。 13. 附录目录 . 错误!未定义书签。 1 目的 对苦参膜中的含量测定检测方法进行确认，确保方法的可行性，以便为有效控制苦参膜的含量提供依据。 2 范围 本方案适用于*药业股份有限公司齐墩果酸片含量测定方法的确认。 3 验证机构与职责 3.1验证小组成员 姓 名 所在部门 在验证中担任职务 签名 组长 组员日期 组员 职责3.2 3.2.1 验证小组组长职责 保证确认方案及各种检查表的起草。3.2.1.1 3.2.1.2 保证在执行前完成对确认方案

3、及各种检查表的审核和批准。 负责对确认小组成员进行本方案的培训。3.2.1.3 3.2.1.4 保证完全按照确认方案实施。确保能及时发现偏差，并按照已经达成一致的偏差处理方法对其进行记录、纠3.2.1.5 正、调查和最终确认。 3.2.1.6确保确认报告的生成、审核和批准。 QA职责 3.2.2 执行前完成对确认方案及各种检查表的审核。3.2.2.1 负责确认过程的监控和检查，保证确认方案的实施，参与确认结果评价。3.2.2.2 参与确认偏差的调查、处理、和评估。 3.2.2.3 确认过程中，如有变更，保证按变更处理程序执行。 3.2.2.43.2.3 其它成员职责 3.2.3.1 执行前确认

4、确认方案已批准，并经过培训。 3.2.3.2 按确认方案实施确认，收集、整理确认数据，完成确认记录和报告。 3.2.3.3 参与确认偏差的调查和处理，确认通过偏差修订和解决方案。 3.2.3.4 确认确认过程中的变更在实施前已经批准。 4 定义 4.1 线性：指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 4.2 准确度：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。 4.3 重复性：再规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价。 4.4 中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员或用不同设备测定结果之间的精密度， 称为中间精密

5、度。 5 参考文件 5.1 药品生产质量管理规范（2010年修订版） 5.2 药品生产验证指南 5.3 中国药典（2015年版）二部 5.4国家药品监督管理局国家药品标准 5.5 公司相关文件： 5.5.1 苦参膜质量标准及检验规程（） 5.5.2 验证管理（） 5.5.3 变更控制操作规程（） 5.5.4 偏差处理操作程序（） 5.5.5 纠正措施与预防措施操作规程（） 5.5.6 2016年度验证总计划 风险因素分析 6 风险评估将采用失效模式及影响（FMEA）的工具来评估和衡量方法参数失效后对产品分析结果的影响。评估过程将参照公司质量风险管理的要求，风险等级为低、中、高级别的必须给出合理

6、的建议措施，之后再次对建议的风险控制措施进行评估以确保风险的降低，分析、评估结果见附录1风险评估表。 7 验证准备 确保所有方法SOP是最新版本且经过批准，将检查结果记录在附录2文件检查内。 确认参与验证的人员都经过此方案和相关SOP的培训，和识别所有签字和草签本方案任何数据表的人员。将检查结果记录在附录3培训检查和签名确认内。 7.3 确认验证过程中用到设备、计量仪器都是经过校验，并在有效期内，将检查结果记录在附录4确认用仪器/仪表校准检查内。 8 检测方法的描述 药品与试剂的准备 *对照品（中国药品生物制品检定院提供），*（为*药业股份有限公司生产）；硅钨酸试液、碘化汞钾试液、苦味酸、氯仿

7、、甲醇、浓氨、稀碘化铋钾试液、盐酸液（L）、氢氧化钠液（1mol/L）、氢氧化钠滴定液（L）、硫酸滴定液（L）、甲基红示液、磷酸、乙腈、无水乙醇。 仪器分析条件 电子天平（FA2014）、超声池（KQ-300DE）、电热恒温水浴锅（DK-98-1）、高效液相（LC-10ATVP) 8.3 检测方法 显色鉴别、色谱鉴别、酸碱滴定法、高效液相色谱法 检测操作 鉴别 显色鉴别：样品连续三批，A、B两位组员各取样品1号、样品2号约，分置三支试管中，加水2ml使溶解，分别加硅钨酸试液、碘化汞钾试液及苦味酸试液12滴，分别生成白 色、淡黄色及黄色沉淀。15使溶解，超声提取B两位组员分别取本品，加甲醇10m

8、l薄层鉴别：样品连续三批，A、分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；另取苦参碱及氧化苦参碱对照品适量，加甲醇制试验，取上述三种）的溶液作为对照品溶液，照薄层色谱法（附录 B成每1ml中各含5mg薄层板上，以三氯甲%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G3溶液各2l，分别点于同一以）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色-浓氨试液（5:烷-甲醇 谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点。片，剪碎，取一片重两2，各10酸碱滴定法：连续三批样品，两位组员分别取样品1、样品小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣3次，每次1份，各精密称定，加氯仿25ml回流分次洗涤容器，洗液并入使溶

9、解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml用L盐酸液5ml次摇匀，用三氯甲烷振摇提取56g与1mol/L氢氧化钠液5ml,分液漏斗中，加氯化钠约振摇洗涤，再每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml、10ml）,（25、20、10、10的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定1g依次分别通过同一装有无水硫酸钠，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤20mlL）10ml及新沸过的冷水液（，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室10ml3次，每次）相当于的L）滴定。每1ml的硫酸液（2温，加甲基红指示液滴，用氢氧化钠滴定液（L OCHN。152242 dr%

10、）不得超过%本品每片含总生物碱以*%。相对偏差（ 计算公式：CC?31?V?T?mV?12 CC?42?100C? 0000 100M?C1：硫酸滴定液的实际浓度（mol/L)； C2：硫酸滴定液的理论浓度（mol/L)； C3：氢氧化钠滴定液的实际浓度（mol/L)； C4：氢氧化钠滴定液的理论浓度（mol/L)； V1：加入硫酸滴定液的体积（ml)； V2：消耗氢氧化钠滴定液的体积(ml)； T ：标示量（； m ；(g)片苦参膜的平均重量20：该批 M ：使用苦参膜的量（g)。 .4高效液相色谱法 色谱条件与系统适用性试验：用氨基键合硅胶为填充剂：以乙腈-无水乙醇-3%磷 酸溶液（85:

11、）为流动相；柱温30，检测波长为220nm，流速min，理论塔板数按氧化苦参碱峰计算，应不低于5000。 对照品溶液的制备： 取*对照品适量，精密称定，置同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:15）制成每1ml含苦参碱和氧化苦参碱35g的溶液，摇匀，即得。 供试品溶液的制备： 取已剪碎的样品约，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用m滤膜滤过，即得。 测定法： 分别精密吸取对照品溶液5l与供试品溶液510l，注入高效

12、液相 色谱仪，测定，即得。本品每片含*不得少于 mg。相对标准偏差不得过2%。 计算公式: A?A21 ?A 2样品峰面积?对照品浓度?稀释倍数mg/g?C样品平均片重 对照品平均峰面积?样品称量 : 对照品进两针的平均峰面积； A : 对照品第一针峰面积； A1 : 对照品第二针峰面积。 A29 验证实施 线性实验 目的：在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度应符合规定。 滴定法 实验过程同一人同时取同一批样品，各10片，剪碎，取一片重样品1、样品2、样品3、样品4、样品5，各精密称定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用L盐酸液5ml

13、使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（L）滴定。每1ml的硫酸液（L）相当于的CHNO 。24221

14、5本品每片含总生物碱以氧化苦参碱(CHN)计，应为标示量的%。相对偏差（dr%）2O1524不得超过%。 以样品滴定过程中消耗氢氧化钠的体积为横坐标，以样品含量为纵坐标，绘制回归方程。 可接受标准（相关系数dr%）。 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定线性实验记录内，见附录。 高效液相 对照品配制：取*一瓶精密称取置25ml容量瓶中、*对照品两瓶精密称取置50ml量瓶中，加乙腈：无水乙醇（85:15）溶解至刻度。分别精密量取氧化苦参碱、苦参碱5ml；氧化苦参碱1ml、苦参碱10ml；氧化苦参碱2ml、苦参碱20ml，分别置25ml容量瓶中，加乙腈：无水乙醇（85:15）至刻度。既得。 样品制

15、备：取已剪碎的样品约，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用m滤膜滤过，即得。 测定法： 分别精密吸取对照品溶液5l与供试品溶液510l，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品每片*，不得少于 mg。 以对照品的吸取量（峰面积）为横坐标，以样品含量（峰面积）为纵坐标，绘制回归方程 ）。2%RSD可接受标准（相关系数 记录：将实验结果记录在*高效含量测定线性实验记录内，见附录5。 重复性实验 目的：在规定范围内，取同一

16、批次的样品品，用5个测定结果进行评价，得到的结果RSD应符合要求。 滴定法： 实验过程 取同一批样品，10片，剪碎，取一片重样品1、样品2、样品3、样品4、样品5各精密称定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（L）10ml

17、及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（L）滴定。每1ml的硫酸液（L）相当于的CHNO 。215224本品每片含总生物碱以*%。相对偏差（dr%）不得超过%。 可接受标准（相关系数dr%）。 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定重复性实验记录内，见附录5。 高效 实验过程 对照品配制：对照品溶液的制备： 取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:15）制成每1ml含苦参碱和氧化苦参碱35g的溶液，摇匀，即得。

18、 样品制备：取同一批样品10片，剪碎并分别取样品1、样品2、样品3、样品4、样品5约，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙 滤膜滤过，即得。m量瓶中，摇匀，用25ml）定溶至85:15无水乙醇（-腈测定法： 分别精密吸取对照品溶液5l与供试品溶液510l，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品每片含苦参总碱以苦参碱(CHNO)与氧化苦参碱（CHNO）的总量计，22415152422不得少于 mg。 可接受标准（相关系数RSD2%）。 记录：将实验结果记录在*高效含量测定

19、重复性实验记录内，见附录5。 中间精密度实验 目的：含量测定中，一个实验室内不同的人、在不同时间（通常是不同天）测定得到的结果RSD应符合要求。 滴定含量 实验过程 两名实验人员分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦参膜10片，精密称定，剪碎，各精密称取本品3份（每份约），加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振

20、摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（L）滴定。每1ml的硫酸液（L）相当于的CHNO2。24215 可接受标准（同一人实验结果RSD%；两人间的RSD%） 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定中间精密实验记录内，见附录5。 高效 两名实验人员用同一批对照品分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦参膜10片，精密称定，剪碎，各精密称

21、取本品3份（每份约），置具塞锥形瓶中，加浓氨水，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至25ml量瓶中，摇匀， 滤膜滤过，即得。m用测定法： 分别精密吸取对照品溶液5l与供试品溶液510l，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品每片含苦参总碱以苦参碱(CHNO)与氧化苦参碱（CHNO）的总量计，22421515242不得少于 mg。 可接受标准（同一人实验结果RSD%；两人间的RSD%）。 记录：将实验结果记录在*高效含量测定中间精密度实验记录内，见附5。 含量测定准确度实验

22、目的：含量测定中，用已确定的方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示，得到的结果RSD应符合要求。 实验过程 精密称取同一已知含量的供试品9份（每份约），分别置于圆底烧瓶中，分成三组，分别向第一组的每一份供试品中加入浓度为（35g/ml）的氧化苦参碱对照品2 ml；向第二组的每一份供试品中加入浓度为（35g/ml）的氧化苦参碱对照品5ml；向第三组的每一份供试品中加入浓度为（35g/ml）的氧化苦参碱对照品7 ml。加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏

23、斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（L）滴定。每1ml的硫酸液（L）相当于的CHNO2。215 24 测定法 将测得的总含量减去供试品中已知含量，计算每组的回收率。 可接受标准（实验结果回收率%）。 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定准确度实验记录内，见附录8。 高效 对照品制备：对照品溶液的制备： 取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置同一量瓶 的溶液，摇匀，即得。g35含苦参碱和1ml）制成每85:15无水乙醇（-中，加乙腈 供试品制备： 精密称取同一已知含量的供试品9份（每份约），置具塞锥形瓶中，加浓氨水，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损