细胞工程：8-1 动物细胞培养与制药

1、1,第四篇：生物产品生产,第8讲 动物细胞培养生物制药,2,本节主要内容,动物细胞培养的特点 动物细胞培养的条件、方式 原代培养、传代培养技术 适合大规模培养的细胞系 动物细胞培养的生物反应器 微载体及其培养特点 动物细胞培养的影响因素与培养工艺,3,本节关键问题,动物细胞体外生长特点 动物细胞培养的培养基特点 动物细胞原代培养方法 动物细胞传代培养方法 常用的大规模培养的动物细胞株特点 适合动物细胞大规模培养的生物反应器 微载体培养技术 动物细胞培养的影响因素及灌注培养工艺,4,第一节：动物细胞培养,5,（一）动物细胞培养,1、定义：动物细胞培养（Animal cell culture）是模

2、拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。 2、历史： 1907年：哈里森（Harrison）：盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活了几周时间，开创了动物组织培养的先河。 1923： 法国学者卡雷尔（Carrel）设计的卡氏培养瓶用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，推动了动物细胞培养技术的建立。 1951年：适合动物细胞体外培养的培养基建立。,6,3、应用领域,生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用蛋白。 基础研究的细胞材料：细胞模型 种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子细胞。,7,4、特点,需氧量少、剪切力敏感。 生长缓慢，营养苛刻、

3、易受污染。 细胞培养世代数有限（原代细胞50代），除癌细胞和发生转化的细胞。 以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面生长。,体外生长的动物细胞一般具有贴附、细胞接触性抑制、密度抑制的特点。,8,接触性抑制(Contact inhibition) 是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象。 由于这个特性，正常细胞并不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。 密度抑制(Density inhibition) 当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象。,9,悬浮型细胞：极少数细胞可在培养液中悬浮生长。血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等 贴附型细胞：大多数哺乳动物细胞必须附

4、着在带适量正电荷的固体或半固体表面才能生长。属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：,5、培养细胞的类型,10,（1）成纤维型细胞,外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则形。成群细胞呈现放射状、旋涡状等形式。多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙。,11,（2）上皮型细胞,扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。 因为相互拥挤而呈现“铺路石状”，局部可以单层的上皮状“膜片组织”。 皮肤的表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等。,12,（3） 游走型细胞,13,（4）多形型细

5、胞,14,（二）动物细胞培养的条件,严格的无菌技术:细菌真菌支原体病毒交叉污染 1.培养基 对于营养要求非常苛刻，氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子等。 包括：天然、合成、无血清培养基三种。,15,1.1 天然培养基,动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液、鸡胚胎汁等。 血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝或去纤维蛋白法)的血浆。 优点：营养价值高 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高,16,血清的生物功能,提供基本营养物质 提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等。生长因子如表皮生长因子、血小板生长因子等。 提供结合蛋白：携带重要的低分

6、子量物质，如转铁蛋白携带铁。 对培养中的细胞起到某些保护作用：提供促接触和伸展因子；血清蛋白形成了血清的粘度；一些微量元素和离子。,17,1.2 合成培养基,优点：成分已知，便于对实验条件进行控制。 缺点：无法替代一些未知成分 解决途径 合成培养基中添加小牛血清，彼此互补 目前常用的合成培养基包括：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等,18,1.3 无血清培养基,血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的成分 血清培养基缺点： 动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用. 动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程不易检测控制。 虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养产物的分离、提

7、纯以及检测造成一定困难。,19,无血清培养基,无血清培养基(Serum free medium,SFM)：是不含血清的动物细胞培养基，由基础培养基和添加组分组成。试图全部替代血清成分。 基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。 添加组分主要包括：细胞外基质、生长因子、结合蛋白与转运蛋白、酶抑制剂等。,20,21,2 其他溶液：,2.1 平衡盐溶液（Balanced salt solution，BSS） 主要由无机盐组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、碱度平衡的功能。 例如：Hanks液 酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。,22,2.2 培

8、养基pH调整液,大部分合成培养液都呈微酸性。 常用pH调整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。 HEPES是一种非离子两性缓冲液，其在pH 7.2 - 7.4范围内具有较好的缓冲能力： 化学名：2-4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylethanesulfonic acid。 中文名：羟乙基哌嗪乙硫磺酸。 分子式：C8 H18 N2 O4S,23,2.3 细胞消化液,用途： 从组织块消化分散得到单个细胞 传代培养时分散细胞 组分： 胰蛋白酶溶液：水解细胞间的蛋白质，加血清终止反应 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化液：解离细胞 两者常结

9、合使用，增加效果,24,2.4 抗生素溶液,防止微生物污染。 常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等。,25,3、培养条件,影响动物细胞体外生长的因素包括生物因素、化学因素、物理因素。 生长条件的控制主要包括温度、pH、渗透压、气体等。 温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为36.55。 pH：哺乳动物细胞为7.1-7.3。 渗透压：细胞在高渗透压或低渗透压溶液中会发生皱缩或肿胀，甚至破裂。 气体：细胞的生长代谢离不开气体，主要包括O2和CO2。二氧化碳培养箱。,26,4、培养工具,培养瓶/板：适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。 滤器：不能高温灭菌,27,（三）动物细胞培养方

10、式,动物细胞培养可以分为贴壁培养、固定化培养、悬浮培养三大类。 1、贴壁培养（Adherent culture）是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。 优点：容易更换培养液；容易采用灌注式培养、不需过滤系统；同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例、适用于所有类型细胞。 缺点：扩大培养比较困难、投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长。,28,1.1 贴壁材料,要求：具有亲水性、正电荷。 常用材料：硅硼酸玻璃（卡氏培养瓶等）、聚苯乙烯（96孔培养板等） 对微载体而言还要求具一定三维结构。,29,1.2 贴附生长过程,游离期：接种的细胞呈悬浮态 吸附期：多数细胞都可在24小时内贴壁。 繁殖期：

11、悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。出现接触性抑制。 退化期：细胞长满培养瓶壁，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞会从瓶壁上脱落死亡。,30,2、固定化培养,类似植物细胞固定化培养的方法 优点：具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。,31,3、悬浮培养,主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、血液白细胞、淋巴细胞，某些肿瘤细胞等属于此类细胞。 贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可实现悬浮培养。,32,（四）动物细胞小规模培养,1、悬滴培养/灌注小室培养 2、培养瓶/板培养法 是目前

12、动物细胞小规模培养的主要方法之一。,33,3、转管法,4、饲养/滋养层培养,指一些特定细胞，经有丝分裂阻断剂（常用丝裂霉素）处理后所得的细胞单层。 是动物细胞培养、尤其是胚胎干细胞培养常用的生长增值促进剂和分化抑制剂。 比较常用的饲养层细胞就是胚胎成纤维细胞，以及颗粒细胞、输卵管上皮细胞等。 滋养层细胞：哺乳类早期胚泡壁的单层细胞所形成的薄膜。,34,35,（五）动物细胞原代培养,接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞再进行培养，在首次传代前的培养称为原代培养（Primary culture）。 一般持续1-4周。在这个阶段，细胞有分裂但不旺盛。 细胞多呈二倍体核型。 优点：组织和细

13、胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内的形态学特征。是很好的实验材料，例如药物测试、研究细胞分化等。,36,1、组织块原代培养,是常用的简易的原代培养方法。 1）用吸管吸出组织块一一一般每小块间隔为0.2-0.5厘米，使其均匀贴在培养瓶的壁上。 2）然后将贴有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞上瓶塞，倾斜置于37的CO2 培养箱内培养，2-4小时后将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养。24小时后再补充培养液，一般3-5天更换培养液。 3）一般情况下，组织块贴壁后24小时细胞就从组织块四周长出，5-7天组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落，组织块四周的贴壁细胞也逐渐形成层片。,37,2

14、 细胞原代培养,酶解制备单细胞 根据不同的组织对象采用适当的酶消化液获得动物细胞进行培养。 胚胎等组织细胞潜伏期短，第二天既可见生长，一周便可接连成片； 成体组织来源的细胞潜伏期长，一般要一周左右。 最常用的有胰蛋白酶和胶原酶，链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。 EDTA适合消化传代细胞，常与胰蛋白酶一起使用,38,（六）动物细胞传代培养,传代培养（Passage culture/Subculturing）是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。 细胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。 注意：每进行一次分离再培养称为传一代。这里的传代代数与细胞代数或倍增不同，“一代”是指从细胞接种培养到分离再培养期间的一段时间。 在细胞一代中，细胞约能倍增36次。,39,1、传代培养方法,悬浮生长的细胞 加入新鲜培养基后直接吹打分散传代， 对于贴壁生长的动物细胞，一般采用酶消化法进行传代培养。 视频：传代培养,40,酶消化传代方法,41,2 动物细胞培养的一般过程组织获得与消化、接种、原代培养、传代培养,42,43,3、细胞培养过程分析,细胞计数活力分析细胞形态生化与分子分析 倒置显微镜：物镜与照明系统颠倒，用于观察培养的活细胞。,44,细胞培养过程分析,细胞形