《基因组测序与分析》PPT课件.ppt

1、第八章 基因组测序与分析,西北农林科技大学农学院遗传教研组,主讲人：胡银岗,第一节 基因组计划,1、人类基因组计划简介 人类基因组计划准备用15年时间，投入30亿美元，完成人类全部24条染色体的3109脱氧核苷酸对(bp)的序列测定，主要任务包括作图(遗传图谱、物理图谱的建立及转录图谱的绘制)、测序和基因识别。其中还包括模式生物(如大肠杆菌、酵母、线虫、小鼠等)基因组的作图和测序，以及信息系统的建立。作图和测序是基本的任务，在此基础上解读和破译生物体生老病死以及和疾病相关的遗传信息,基因组 一个物种中所有基因的整体组成,2. 人类基因组测序策略,采集5个自愿者的DNA样品,构建3种不同插入子大

2、小的基因组文库2Kb, 10Kb和50Kb,完成约2700万次插入子末端测序,总长14800Mb,GeneBank下载104018个BAC末端顺序,PFP发表的公开数据主要为BAC克隆的顺序,共4443.3Mb,随机测序与序列组装方法 指导测序与序列组装方法 相结合进行序列组装,A. Celera Genomics 人类基因组的测序策略,B 国际人类基因组测序策略 构建BAC克隆 限制性酶处理获得指纹 根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群 根据STS标记,将BAC克隆重叠群标定在物理图上 每个BAC克隆内部采用鸟枪法测序,组装 将BAC插入顺序与BAC克隆指纹极重叠群对比,将已阅读的顺序锚定到

3、物理图上,两种策略的比较,鸟枪法策略 指导测序策略 不需背景信息 构建克隆群 (遗传、物理图谱) 时间短 需要几年的时间 需要大型计算机 得到的是草图(Draft) 得到精细图谱,3.人类基因组研究的惊人发现, 19号染色体是含基因最丰富的染色体，而13号染色体含基因量最少 目前已经发现和定位了26000多个功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能 人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠”。在染色体上有基因成簇密集分布的区域，也有大片的区域只有“无用DNA” 不包含或含有极少基因的成分。基因组上大约有14的区域没有基因的片段。 353的基因包含重复的序列。这说明那些原来被认为是“垃圾”的DNA

4、也起重要作用，应该被进一步研究。,4.单核苷酸多态性,人类999的基因密码是相同的，而差异不到01，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础，个体的多样性被认为是产生遗传疾病的原因。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。,5.Shotgun测序及分析,DNA的提取和纯化 载体预备：和DNA片断结合，从而能够在细菌中扩增。 DNA片段的制备：将DNA用超声波切成能够测序的小片断 转化培养：小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增。 提质粒：从细菌中提取出繁殖好的质粒 电泳

5、检测：检测质量的好坏 测序：上测序仪测序,DNA整体,切成小段,小段和载体结合,结合后进行测序,还没有完！拼接！,因为整个基因组太长（上M),而每次只能测得一个500的小片断(read) 问题：如何根据read恢复原始顺序？ 类比：10本圣经，都从随机点起始剪成500个字母左右的小纸条，问：给你这么一堆小纸条，你能读出圣经来吗？ 但是都会拼错！,Shotgun法序列拼接,Consensus,Mis-Assembly (Inverted),拼接错误：Repeat的存在,实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装,超声波打断纯化的基因组DNA 琼脂糖电泳收集1.62.0Kb的区段、纯化 构建到质粒载

6、体中 随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11 631 485 bp 组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群, ,各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙 ,载体或宿主菌 选用不当而被丢失的序列,测序时遗漏的测序,解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库,解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库,运用计算机软件进行序列拼接,Francis Collins VS. J.Craig Venter,6. 基因识别,基因识别（gene identification）是HGP的重要内容之一，其目的是识别全部人类的基因。 基因识别包括： 识别基因组编码区

7、识别基因结构 基因识别目前常采用的有二种方法： 从基因组序列中识别转录表达的DNA片段 从cDNA文库中挑取并克隆。,7. 模式生物的基因组测序,酵母,大肠杆菌,果蝇,线虫,老鼠,水稻基因组测序,水稻是全球半数以上人口的主食，对解决全球粮食问题具有重要意义。 2002年我国科学家完成了水稻基因组定序和初步分析。出人意料的是，水稻的基因竟比人类基因还要多得多。人类基因大约有3万多个，水稻有4万多个基因。 水稻基因组可说是继人类基因组之后，完成定序的最大基因组，也是至今已知最大的植物基因组。,8.人类基因组计划对医学事业的影响,促进对致病基因的克隆 疾病的预测与诊断 如果掌握了与某种疾病相关的基因

8、及突变，则可以对该疾病进行预测、诊断。 基因疗法的发展与应用 通过生物学、医学等技术对疾病相关基因进行抑制或调控，即可达到治疗某一疾病的效果。,基因变异与疾病,第二节 DNA片段组装,大规模基因组测序 得到待测序列的一系列序列片段 这些序列片段覆盖待测序列 序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。,目标序列 序列碎片,（1）碱基标识错误,1. 片段组装的4个主要问题,（2）不知道片段的方向,（3）存在重复区域,（4）缺少覆盖（gap）,2、序列片段组装过程,序列片段组装过程三个步骤： 首先进行序列片段的两两比较，确定可能的片段之间的覆盖（或者重叠）； 确定所有片段统一的覆盖模式，即确定各个序列片

9、段的相对位置； 最后确定片段组装结果，即确定目标序列。,1、基因组DNA的奥秘 遗传信息存贮在4种字符组成的核酸序列中 “天书”用遗传语言书写的人类遗传蓝本 包含的信息量巨大 更重要的是目前人类对它了解甚少 天书中只有4个字符（碱基A、T、G、C） 既没有段落，也没有标点符号 是一个长度为3109的一维序列。,第三节 基因组DNA序列分析,科学家对这本天书了解最多的部分就是遗传密码 密码子的特点 （1）密码子的使用是非随机的 如果密码子的第一、第二位碱基是A、U，那么第三位将尽可能使用G、C；反之亦然。 如果三位都用G、C，则配对容易，分解难；三位都用A、U，则相反。 一般地说，高表达的基因，

10、要求翻译速度快，要求密码子和反密码子配对快、分手也快。,（2）密码子的使用有一定的统计规律 对同义密码子的使用存在着偏爱 不同种属偏爱的密码子不同 人类基因组： 密码子第三位取A、U的情况占90% 而第三位取G、C仅占10% 密码子的使用偏爱性与基因功能 蛋白质结构相关,（3）密码子中的密码 三个碱基的位置与所编码的氨基酸性质存在着联系 例如： 芳香族氨基酸 以U作为第一位碱基 中间位置碱基的性质与氨基酸是亲疏水性相关 疏水氨基酸的密码子，其第二位碱基是U 亲水氨基酸的密码子，其第二位碱基是A 第二位碱基是G、C的密码子所编码的氨基酸亲水性、疏水性居中。,基因组信息 人类基因组： 编码区域只占

11、1%-3% 对于非编码序列，尚不清楚其含义或功能 非编码区域对于生命活动具有重要的意义 包括内含子、简单重复序列、移动元件、伪基因 重复序列: 卫星（satellite）DNA 小卫星（mini-satellite）DNA 微卫星（micro-satellite） 顺式调控元件: 启动子、增强子、沉默子,2、探索遗传语言 用语言学的方法进行研究 自然语言 计算机程序设计语言 遗传语言 二进制序列0、1的长程关联性分析结果： 编码区域 自然语言 蛋白质编码区域所包含的信息相当于待加工的“数据”，数据经过加工处理以后产生对应的蛋白质； 非编码区域 程序设计语言 而非编码区域则相当于“程序”或“指令

12、”，确定如何在时间和空间方面控制基因的表达和蛋白质的合成,用密码学方法进行研究 是否存在其它密码？ 调控信息密码？ 蛋白质结构的密码？ 编码在DNA上的一维程序如何在四维时空中控制生命体的生长发育？,3、关于生物复杂性 生物的复杂性不仅仅是基因的数目 人类基因约为30000个 线虫有20000个基因,230000/220000=210000103000,4、基因组计划带来的希望 实验数据的积累速度在迅速地增加 计算机科学和技术也在不断地发展,单个基因组分析 基因序列 基因功能 基因的表达调控 基因产物 基因多态性,比较基因组分析 物种关系 物种进化 物种起源,人、鼠基因组比较,人基因组 鼠基因

13、组 注：鼠染色体上的颜色和数字代表在人染色体上对应的片段。,老鼠约75%的基因与人类相同。,第四节 基因组序列诠释,问 题,基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？ 基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？,主要内容,寻找基因 获取基因的全长cDNA序列 确定DNA顺序中基因的位置 研究基因的功能 基因表达 蛋白质组学,1. 寻找基因,1.1 根据开放读码框预测基因 起始密码子 ATG 第一个ATG的确定则依据Kozak规则（基于已知数据的统计结果，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律。） 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则K

14、ozak规则可描述如下： 第4位的偏好碱基为G； ATG的5端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； 在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； 除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。,信号肽分析 信号肽分析软件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把预测过程中证实含完整mRNA 5端的Contig翻译为蛋白序列; 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽; 假如在该测试序列的第一个Met 5端存在终止密码子

15、，该序列为信号肽的可能性更大。,终止密码子 终止密码子: TAA, TAG,TGA GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次； GC% 50% 终止密码子每100200 bp 出现一次； 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。 3端的确认 3端的确认主要根据Poly(A)尾序列,若测试Contig不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。,非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度不少于100 个密码子，有的不到50个密码子甚至更少； 密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不

16、同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。 不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为GCA，GCC或GCT，而GCG很少使用。,外显子内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如： 内含子的5端或称供体位（donor site）常见的顺序为 5AGGTTAAGT-3； 3端又称受体位（acceptor site), 多为5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)； 上游控制顺序 几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。 另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，

17、如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。,1.2 mRNA的5端即转录起始位点区 通过同源性比较来预测mRNA的5端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库。 The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. ( http:/www.epd.unil.ch/ ),1.3 同源查询途径 通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。 同源有如下几种情况： DNA序列某些片段完全相同； 开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子； 开放读码

18、框翻译成氨基酸序列的相似性； 模拟多肽高级结构相似,1.4 试验分析 Northern 杂交确定DNA片段是表达序列： 注意事项： 当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息； 考虑组织专一性和发育阶段的问题； 基因表达产物丰度的问题 如果丰度较低，用拟Northern 杂交和动物杂交（Zoo-blotting）分析； 拟Northern 杂交 根据已知的DNA顺序设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交。,2 获取基因全长cDNA序列,构建cDNA文库，用目的基因DNA片段筛选文库。 根据已知片段设计引物，RACE 技术得到基因的全长cDNA序列。,3.确定DNA顺序中基因的位置,通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域； 通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；,