《发酵工艺条》PPT课件.ppt

1、本章内容：,第一节，微生物的营养要求,（微生物们需要吃什么？）,第三节，发酵生产中培养条件的确定,（怎样让微生物健康的工作？）,第二节，培养基,（如何给微生物们做饭？）,第三章 发酵工艺条件的确定,第一节 微生物的营养要求,一、微生物细胞的化学组成,微生物细胞,水：70%-90%,干物质,有机物 蛋白质、糖、脂、核酸、维生素等 及其降解产物,无机物（盐）,细胞化学元素组成：,主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等； 微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。,微生物生长需要六大营养要素：,碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水,二、营养物质,第一节 微生物的营养要求,

2、微生物生长所需要的六大营养物质及其生理功能,第二节 培养基,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础,培养基：是用于维持微生物生长繁殖和产物形成的营养物质。,任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：,任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；,常规高压蒸汽灭: 1.05kg/cm2,121.3 15-30min； 某些成分进行分别灭菌:过滤除菌；,第二节 培养基,一、选用和设计培养基的原则和方法,在微生物学研究和生长实践中，配置合适的培养基是一项最基本的要求。,原则：1 、目的明确 2、营养协调 3、理化适宜4、经济节约,1 、目的明确,培养何菌？ 获何产物？ 实验室研究或生

3、产大批产品用？ 生产含氮高或低产物？ 种子培养基或发酵培养基？ 目的不同方案不同,一、选用和设计培养基的原则和方法,2、营养协调 （1）选择适宜的营养物质,实验室一般培养：普通常用培养基； 遗传研究：成分清楚的合成培养基； 生理、代谢研究：选用有利于代谢的培养基；,例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：逆境培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,一、选用和设计培养基的原则和方法,（2）营养物质浓度及配比合适,营养物质的浓度适宜； 营养物质之间的配比适宜；,高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能 维持和促进微生物的生长，

4、反而起到抑制或杀菌作用。,培养基中营养物质之间的配比直接影响微生物的生长繁殖和 代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。,发酵生产谷氨酸时： 碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少； 碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量积累。,1斜面培养基,斜面培养基主要是用于： 1)生长繁殖培养基，包括细菌、酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸皮培养基等。 2)菌种保藏培养基；,工业发酵中,培养基往往是依据生产流程和作用分:,斜面培养基 种子培养基 发酵培养基,2.种子培养基,包括：摇瓶种子和小罐种子培养基。 目的：培养种子 1.促进生长，增加细胞数量使其大

5、量繁殖； 2.必须培养出强壮、健康、活性强的“种子”。,种子培养基满足2特点： 1. 必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。 2. 成分应与发酵培养基的主要成分相近。,3.发酵培养基,地位：发酵生产中最主要的培养基，不仅采用大量原材料，也是生产能否成功的关键。 作用：最大限度的获得目的产物，因此必需根据菌体的生长规律和产物合成特点设计培养基。,发酵培养基的共性,单位培养基能够产出最大量的目的产物； 能够使得目的产物合成速率最大； 使副产物合成量最少； 采用的培养基应该质量稳定、价格低廉、易于获得； 不影响搅拌性能和发酵产物后处理。,3.发酵培养基设计原则,1.提供必要的营

6、养成分; 2.利于减少培养基原料单耗，提高单位营养物质的转化率。 3.利于提高产物浓度，以提高单位容积的生产能力。 4.利于提高产物合成速度，缩短发酵周期。 5.减少副产物的形成，便于分离纯化。 6.原料价格低廉。 7.原料尽量不对搅拌和通气产生影响，利于O2的利用率 8.利于产品的分离纯化，尽量减少产生“三废”物质。,注 意,代谢调节物的影响：有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。 1）前体物质； 2）诱导剂； 3）阻遏物或抑制剂 4）金属离子,(1) 前体物质,前体：是指某些化合物添加到发酵培养基中，能直接在生物合成过程中结合到产物中去，而其自身的结构未发生太大变化，

7、却能够提高产物产量的一类物质。 在发酵中添加少量的前体物质将有利于产物的合成和显著提高产量，但浓度过大起抑制作用。,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,(2)添加促进剂（诱导物）,工业用微生物酶多数为诱导酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。 诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。 酶的正常底物或底物类似物都可作为诱导物。 在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导物，例如淀粉、糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化酶的诱导物。只有添加这些物质的培养基，才能获得高产。,(1)添加前体物质,添加前体物质方法：流加法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利,一般基础料中仅仅添加0.07%，前体相对价格

8、较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，用量不要大于0.1。,(3)注意阻遏物或抑制剂的影响,培养基中存在反馈阻遏物能影响酶的合成，降低发酵产量。,(4) 金属离子的影响 有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感，因为有些金属离子是中间代谢酶抑制剂或激活剂。,对于有重大影响的金属离子必须严格控制。 柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量； 钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用； 钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的。 因此，在培养基配制时都必须予以注意。,铁是细胞色素、色素氧化酶、过氧化物酶的组成成分，是微生物有氧氧化必需元素。,钢制发酵罐中，不添加铁，离子浓度达到30ug/ml。,微生物对铁要求敏感

9、： 青霉素生产中，铁 20ug/ml； 柠檬酸生产中，无铁培养基比加铁培养基产率高3倍。,二、工业生产中培养基组成,碳素化合物 氮素化合物 水 微量元素(无机盐类) 生长因子,碳源物质 单双糖：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖； 多糖：淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等，其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。 有机酸：柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸等。,醇类：甘露醇、甘油、低浓度乙醇。 低级脂肪酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸都可用作碳源。 高级脂肪酸：油酸和亚油酸等高级脂肪酸可被放线菌和真菌作为碳源和能源利用，低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长，但浓度较高时往往有毒

10、害作用。 正烷烃：,葡萄糖： 优点：是最易利用的糖，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。 缺点：过多葡萄糖会加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要。 油和脂肪： 在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，氧化成水和CO2。因此用脂肪作碳源时需比糖代谢供给更多的氧。,淀粉：一般要经菌体产生胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。可克服葡萄糖代谢过快的弊病。来源丰富，价格低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀粉。 糖蜜：是制糖厂生产糖时的结晶母液，含有较丰富的糖、含氮化合物和维生素等。,糖蜜使用的注意点：,除糖份外，含有较多的杂质，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵,有害

11、物：生物素（发酵控制）,例：柠檬酸发酵,有害物：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）,除铁处理：黄血盐,氮的来源可分为无机氮和有机氮。 有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。 它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。,(2)氮素化合物,玉米浆：玉米淀粉生产中副产物，其中固体物含量在50。还含有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素等。 由于玉米浆的来源不同，加工条件也不同，因此玉米浆的成分有较大波动。,无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等。 微生物对其吸收利用比有机物快，所以也称速效氮。 利用无机氮时应

12、注意引起的pH变化。,实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等作为氮源，工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等原料作氮源。,无机盐包括大量元素和微量元素，是依据微生物对它们需要量的大小划分。 大量元素：P、S、Mg、K、Ca、Fe等； 微量元素：Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Co等。 当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。 一般在复合培养基中由于加入许多动植物原料等都含有微量元素。,(3)微量元素(无机盐类),(4)生长因子,广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)。包括维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等； 狭义说，生长素

13、仅指维生素。 与微生物有关的维生素主要是B族维生素，是各种酶的活性基团的组成部分。,三、发酵培养基的确定,（1）首先，做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。 （2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解. （3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。,摇瓶优化,3、pH,pH值表示某水溶液中氢离子浓度的负对数值。 纯水呈中性，其氢离子浓度为10-7mol/L，

14、定其pH值为7。,最低生长pH 最适生长pH 最高生长pH,对发酵生产中pH的控制最为重要。 许多抗生素的生产菌也有同样的情况。,不同种类微生物,不同的最适生长pH值,同种微生物在不同生长阶段 和不同的生理、生化过程,抗生素生产菌,可免除了DNA、ATP、菌绿素和叶绿素等重要成分被酸破坏， 或RNA、磷脂类等被碱破坏的可能性。,外环境,pH相当稳定，一般都接近中性,pH变化很大,微生物细胞,内环境,胞内酶,最适pH一般接近中性,周质空间中的酶胞外酶,最适pH接近环境的pH,微生物的生命活动过程中也会能动地改变外界环境的pH，培养基的原始pH在培养微生物过程中会时时发生改变。,可能发生的反应有以

15、下几种,在一般培养过程中往往以变酸占优势，因此，随着培养时间的延长，一般培养基会变得较酸。,pH变化与培养基的组分尤其是C/N有极大的关系，,C/N高 的培养基,经培养后pH值常会明显下降,例如培养各种真菌的培养基,C/N低 的培养基,经培养后pH值则常会明显上升,例如培养一般细菌的培养基,在微生物培养过程中，一项重要措施 如何及时调节合适的pH。,根据表面现象而进行直接、快速但不能持久的调节。,根据内在机制所采用的间接、缓效但能发挥较持久作用的调节。,调节措施,治标,治本,注意培养过程中的pH变化，观察适于菌种生长繁殖和适于代谢产物形成的两种不同pH。其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发

16、酵的影响。,pH值的影响,pH控制摇床,（5）根据经济效益选择培基原料 碳源的代用方向：寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖。同时，使用稀薄的培养基，适当减少碳氮配比。 有机氮源代替：以黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料。代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、酒糟，及各种食品工业下脚料等。,（4）中间补料法 有些发酵产物，如抗生素，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物途径。,一、工业上选

17、用培养基的原则和方法,配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份, 特别是在发酵工业中,以降低生产成本。,以粗代精,以“野”代“家”,对微生物来说，各种粗原料营养更加完全，效果更好。 而且在经济上也节约。,以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等 都是富含淀粉质的野生植物，可以部分取代粮食用于工业发 酵的碳源。,以废代好,以污染环境的废弃物原料：如，糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都可作为原料。 工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村，已推广利用粪便及禾

18、草为原料发酵生产甲烷作为燃料。 另外, 农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。,某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方，设法减去30-50%的 黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。,以无机氮代蛋白,以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价 原料用作发酵培养基的原料，让微生物转化成菌体蛋白质或含氮 的发酵产物供人们利用。,以烃代粮,以纤代糖,开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源。将大量的 纤维素农副产品转变为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的 食品及饮料。,以简代繁,以“国” 代“进”

19、,以石油或天然气副产品代替糖质原料来培养微生物。 生产石油蛋白 将石油产品转化成一些产值更高的高级醇、脂肪酸、环烷酸等 化工产品和若干合成物； 对石油产品的品质进行改良，如脱硫、脱蜡等。,发酵条件的控制,第三节 培养工艺的确定,1)温度 2)氧 3)种龄 4)接种量 5)二氧化碳,一、培养工艺的确定,在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。,代时:每分裂繁殖一代所需的时间.,16h,1、温度对发酵的影响,对细胞生长影响：温度升高，从酶反应动力学来看，生长代谢加快；但由于酶很易热失活，所以高温时菌体易衰老。,对产物形成影响：菌体生长速率、呼吸强度和代谢产物形成速率的最适温度往往是不同的；温度升高

20、，一般产物生成提前； 对发酵液物理性质及溶解氧影响：温度影响氧的溶解和传递，影响一些基质的分解，间接影响生物合成。 对生物合成的方向的影响：反馈抑制随温度变化而改变；,1、温度对发酵的影响,2、影响发酵温度的因素,发酵热的成分 生物热：微生物生长繁殖过程中产生的热 搅拌热：机械搅拌造成的摩擦热 蒸发热：被通气和蒸发水分带走的热量 辐射热：发酵罐罐体向外辐射的热量 显 热：空气流动过程夹带着的热量 Q发酵= Q生物+ Q搅拌- Q蒸发Q显-Q辐射,3、最适温度选择与发酵温度控制,温度变化控制的一般原则 接种后,可适当升高温度，以利于孢子萌发和菌体的生长繁殖； 待发酵液温度开始上升后，应保持在菌体

21、最适生长温度； 到主发酵旺盛阶段，温度应控制产物合成的最适温度； 到发酵后期，温度下降，此时适当升温可提高产量。 选择是相对的，要考虑培养基成分、浓度；溶氧（温升氧降）；生长阶段；培养条件等。,3、最适温度选择与发酵温度控制 最适温度选择,最适温度分最适生长温度和最适产物合成温度，两者往往不同。 如：青霉素分别为： 30和 20 。 青霉素发酵的温度控制 0-5h：30C 6-35h：25C 36-85h：20C 86-125h：25C 这种方式比25度恒温培养提高产量14.7%,温度影响发酵方向,如：四环素产生菌-金色链霉菌，同时产生金霉素和四环素； T350C时，金霉素的合成几乎停止，只产

22、生四环素。 温度还影响基质溶解度。,3、最适温度选择与发酵温度控制 发酵温度控制,进行温度控制时，应考虑的因素 不同菌种在不同生长阶段和生产特性 参考其它发酵条件（通气、培养基成分和浓度、pH值等），如通气条件差时，则最适发酵温度比通气良好时低。,温度影响发酵液的物理性质,温度对O2:温度对发酵液中氧的溶解度影响很大，随着温度升高，气体的溶解度变小，氧的传递速率也会减慢。,3、最适温度选择与发酵温度控制发酵温度控制,温度控制的方法 冷却是主要的方法，通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温，如果气温较高，冷却水温度也较高时，多采用冷媒(盐水)进行降温。 发酵罐的热交换装置： 罐外夹套 罐内蛇管、列

23、管,温度对微生物细胞生长,耐高温的菌种：如果培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备。,粘质沙雷氏菌产 灵菌红素,灵菌红素：是一类天然红色素,具有一定的免疫活性,如抑制真菌、细菌和霉菌等功效,且具有一定的抗肿瘤作用,因此具有很大的药用价值,受到科研工作者的极大关注。,3.氧通风和搅拌,通气可以供给大量的氧。 通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。,CCr,呼吸强度,溶解氧浓度,CCr: 临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶解氧浓度。,溶解氧(DO)是需氧微生物生长所必需的,氧气的供应,O2是难溶于水的气体.

24、 25，纯氧在纯水中溶解度为1.26mmol/L，空气在纯水中溶解度为0.25mmol/L。培养基中更低。 氧气的吸收效率很低。,搅拌能使氧气与培养液充分混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，有利于营养物质和代谢物的分散。挡板则有助于搅拌，使其效果更好。 一般来说，若培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度就大。 过度地、剧烈搅拌导致培养液大量涌泡，容易增加杂菌污染的机会，微生物细胞也不宜剧烈搅拌。,利用透明颤菌血红蛋白（VHb）基因工程菌解决溶解氧不足,透明颤菌血红蛋白（VHb）是透明颤菌属微生物产生的一种蛋白，使透明颤

25、菌这一专性好氧的细菌可在贫氧环境中良好生长。其增加氧的传递。 转基因育种：将透明颤菌血红蛋白基因整合到异源宿主菌中可解决溶解氧不足，提高发酵产量。,溶解氧作为发酵异常情况的指标,1 发酵中污染好气性杂菌发酵23h，溶解氧迅速下降 2 污染噬菌体菌液变稀，溶解氧回升 3 工艺错误、操作故障,接种龄 指接种物或种子的生长年龄，亦即它处在生长曲线上哪一个阶段时用来作种子的。这里指某一群体的生理年龄。,4.种龄与接种量,（2）接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。,种子培养期应取菌种的对数生长期进行接种为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。,4.种龄与接种量,在发酵工业上，为缩短

26、延滞期以缩短生产周期，提高发酵效率，一般采用较大的接种量。,种子：发酵培养基1：10，V/V,大量地接入培养成熟的菌种利与弊 优点： 1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率 2. 有利于减少染菌 缺点： 接种量过多也无必要。培养种子费时，且过多地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。,（1）通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短；,（2）利用对数生长期的细胞作为种子；,（3）接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,（4）适当扩大接种量；,生产实践中缩短延滞期的常用手段,5、CO2 对发酵的影响及控制,CO2既是代谢产物，又是某些合成代谢的一种基质。 双面性：抑制或

27、促进 二氧化碳对发酵的影响2方面： 1、对菌体； 2、对产物。,5、二氧化碳对发酵的影响,1、 CO2对菌体： 促进-CO2效应：在发酵生产中不同微生物或某一生长阶段对二氧化碳有着特殊的要求（促进或必须）； 抑制-通常对菌体生长有抑制作用。CO2的含量达到4%，糖代谢和呼吸速率下降,CO2是E.coil和链霉菌突变株的生长因子，菌体在含有30%的CO2的气体才能生长；环状芽孢杆菌已发芽的孢子在生长初期，对CO2有特殊的需要，称 CO2效应。,CO2浓度达到0.16mol抑制酵母菌的生长； 进气口CO2浓度占混合气体的80%，酵母的活力与对照降低20% CO2的分压0.0810 5 Pa，青霉素

28、合成速度会下降50%,2、 CO2对产物： 需占一定的比例（或分压），过高、过低产量都会下降； 抑制： CO2对某些发酵产生抑制作用。抗生素，组氨酸等； 促进： CO2可通过改变pH而影响发酵生产。,5、 CO2对发酵的影响及控制,原因： CO2作用膜脂质核心部位，改变膜流动性及表面电荷密度，影响膜运输效率，导致细胞生长受限制，形态改变；（HCO3- 影响细胞膜的膜蛋白） 也可产生反馈作用，使pH下降，与其他物质反应，与生长必需金属离子形成碳酸盐沉淀，过分耗氧，引起溶解氧下降等，影响菌体生长和产物合成。,5、 CO2对发酵的影响及控制,发酵液中CO2浓度的影响因素： 细胞呼吸强度； 发酵液流变学特性； 通气搅拌程度； 罐压大小； 设备规模。 CO2浓度的控制方法： 调节罐压、通气量和搅拌速度； 补料。（青霉素：补糖，增加CO2 产生，降低PH。）,1.泡沫,三、培养过程中泡沫及染菌的控制,（1）产生泡沫的原因 通风和搅拌使液体分散和空气窜入，形成气泡； 培养基中成分或微生物的代谢活动产生气泡； 培养基中某些成分(如蛋白质及其他胶体物质)的分子，在气泡表面排列形成坚固的薄膜。因此，气泡不易破裂，聚成泡沫层。,（2）泡沫危害： 影响着微生物对氧的吸收； 妨碍CO2的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发