《分子诊断项目》PPT课件.ppt

1、分子诊断室项目介绍,内 容,1.HBV-DNA荧光定量PCR 2.流式基本应用 3.染色体核型分析,HBV DNA荧光定量PCR,4,PCR技术简介,1985年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室mullis等人发明了具有划时代意义的PCR技术，从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。 1988年PE-cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，从而使PCR技术的自动化成为现实。 Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的发明者Michael分享了1993年诺贝尔化学奖。 随着PCR技术的日臻成熟1995年出现荧光基因探针杂交定量PCR方法,5,PCR基本原理,类似DN

2、A的体内复制，以单链DNA为模板，利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补链的过程。,6,DNA 合成的必备要素,DNA Polymerase dNTPs single-stranded template primer,7,定量PCR概念,以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量的定量,8,常规PCR与定量PCR的比较,9,实时荧光定量PCR原理,指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧

3、光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold=10SD cycle0-15,10,Ct值与起始模板的关系,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,11,荧光定量的标准曲线,标准曲线,未知标本,Crossing Point (Cycles),log (copy number),n,log (F2/F1),n,log (F2/F1),Targ

4、et,38,12,荧光检测模式,（1）SYBR Green I 染料 （2）水解探针（Taqman） （3）杂交探针（Hybridization Probes） （4）分子信标（molecular beacon) 发夹引物（sunrise primer) 蝎状引物（scorpion primer) 复合探针（complex probes),13,探针的5端标记一个荧光基团，3标记另一个荧光基团。5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3端荧光淬灭基团（FRET），正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号。,Taqman探针原理,14,当溶液中模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板

5、结合。在引物的介导下，Taq酶沿模板向前合成子链，当延伸至探针结合处，发生链的置换；,Taqman探针原理,15,Taqman探针原理,Taq酶的53外切酶活性将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3端荧光淬灭基团的屏蔽，发出荧光，荧光信号与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。,16,定量PCR在乙肝检测中意义,1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直

6、传播,17,18,标本留取及检测步骤,标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本避免溶血和脂血。 检测步骤：1.反应液配制 2.核酸提取 3.核酸扩增 结果分析：采用样点拟合法，由标准曲线得到病毒的拷贝或IU/ML。,19,1.分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为试剂准备区，样品处理区，PCR扩增区。 2.试验前实验室应使用紫外消毒至少30分钟。 3.操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时避免飞溅。,注意事项,20,4.每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。 5.所有试剂试验前充分融化，避免反复冻融

7、。 6.每次PCR反应均应设立阴阳性对照。,注意事项,流式基本应用,22,流式细胞术的概念,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征,23,流式细胞仪的检测范围,细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结

8、合位点 细胞受体,24,散射光信号,Right Angle Light Detector Cell Complexity SSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,25,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,26,荧光信号,使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,27,数据分

9、析,数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图（3D Plot）,28,流式的临床应用,淋巴细胞亚群分析 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的免疫状态监测 干细胞计数 阵发性血红蛋白尿 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 HIV免疫分型，CD4绝对计数,29,淋巴细胞亚群分析,使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（CD分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析 各淋巴细胞亚群的百分

10、含量 淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析,30,根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,31,根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为 T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+），即 Th/Ti T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）,即 Ts/Tc Th/Ts比值 可用于评价自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态,32,临床意义,诊断原发性

11、免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如AIDS） 造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B） Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常） Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等,33,临床意义,移植后动态免疫监测： 急排临床症状出现前1-5天，活化T和Th/Ts持续，1.2预示急排； Th/Ts持续表明可能感染，比值1.08，可能性大，0.2应停用免疫抑制剂； 实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察 治疗前常伴T 、Th/Ts，放/化疗有效可恢复； 淋巴细胞免

12、疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好； 探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）,34,淋巴细胞亚群双色分析,35,先天性无 r 球蛋白血症,36,淋巴细胞亚群双色分析,37,HLA-B27, HLA-B27是MHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达 HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27阳性。 其他，如Reiter s综和症阳性率70-90%，银屑病性关节炎阳性率50-60%，葡萄膜炎阳性率40-50% 检测采用全血，无需分离淋巴细胞，操作简单，可以快速、灵敏、准确地分析HLA-B27。 结果报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/

13、阳性结果。实验的灵敏度为100%，特异性为97.5%。,38,流式细胞仪的应用（血液）,白血病和淋巴瘤免疫分型 造血干细胞计数 阵发性血红蛋白尿（PNH）诊断 网织红细胞计数 血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析,39,流式细胞仪的应用（肿瘤）,细胞周期和倍体分析 肿瘤相关基因表达的研究 抗肿瘤药物作用机制的研究 放疗/化疗疗效的研究 多药耐药基因的研究 细胞凋亡的分析 凋亡细胞的分析 凋亡相关蛋白的分析,40,流式标本留取,紫色盖试管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。 不能有凝块。 单细胞悬液细胞数不少于106个。,41,染色体核型分析,42,基本概念,染色体核型

14、：指一个物种所特有的染色体数目和每一条染色体的形态特征。-人类体细胞中共有23对染色体，22对常染色体，一对性染色体。 核型分析：将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征分析的过程称核型分析。如正常女性核型：46,XX 正常男性核型：46，XY。 核型模式图：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。,43,染色体模式图,44,人类23对染色体,45,46,染色体编号(人X染色体),记述一特定带时，需要写明4个内容：染色体号，长短臂，区的号序和带的号序。这些内容按顺序写，不用间隔或加标点。如果某一带被再细分，在原带号数后加一小数点，编号原则仍按从着

15、丝粒往臂端序贯编号。如1p31.2代表一号染色体短臂3区1带第2亚带,47,染色体标本常规制备,方法 ：中期染色体G带显色 原理 ：采用秋水仙素处理培养的细胞，使细胞停留在分裂中期，再用低渗液处理细胞，使细胞胀大，以进行染色体制片。G-带是标本片经过预处理后，用Giemsa染色显示的带纹。,48,操作步骤,细胞培养： 细胞培养液5mL（含植物凝血素），加 0.3mL肝素抗凝全血37培养箱静置培养6872小时。 收获细胞： 终止培养前11.5小时加入秋水仙素。 制片：低渗-预固定-固定-滴片-干燥老化 G-显带，图像分析：胰酶消化， Giemsa染色，采集图像，分析20-30个中期分裂相,49,

16、核型描述,首先列出染色体总数，然后是性染色体组成，接着列出异常的染色体数目或形态。下列统一的命名符号： A-G 染色体组的名称 1-22 染色体编号 X,Y 性染色体 del 缺失 der 结构重排的染色体 dup 重复 inv 倒位 t 易位 +/- 在染色体符号前表示染色体增加或减少，在染色体符号后表示染色体多出或缺少一部分,50,检查适应症及意义,生殖功能障碍 在不孕症、多发性流产和畸胎等有生殖功能障碍的妇夫中至少有7%10%是染色体异常的携带者。常见的有染色体结构异常如平衡易位和倒位以及数量异常如由于女性少一条X染色体造成的45，XO，或多一条Y染色体造成的47，XXY。平衡易位和倒位

17、由于无基因的丢失，携带者本身常并不发病，却可因其生殖细胞染色体异常而导致不孕症、流产和畸胎等生殖功能障碍。性染色体数目异常除可造成不孕外，还常出现第二性征异常。,51,检查适应症及意义,第二性征异常者 如有原发性闭经、性发育不良，伴身材矮小、肘外翻、盾状胸和智力稍有低下,阴毛、腋毛少或缺如，后发际低，不育等，应考虑是否有X染色体异常。常见的X染色体异常有特纳氏综合征和环形X染色体。特纳氏综合征患者比正常女性少一条X染色体，其染色体核型为：45，X0。环形X染色体患者由于某种原因使X染色体两端同时出现断裂，并在断裂部位重接形成，环形染色体越小临床症状越重。早期发现这些异常并给予适当的治疗可使第二性征得到一定程度地改善，也可能获得生育能力。,52,检查适应症及意义,外生殖器两性畸形 根据生