微生物的遗传变异和育种(3)演示课件

1、第七章 微生物的遗传变异和育种,本章的主要内容,概述 第一节 遗传变异的物质基础 第二节 基因突变与诱变育种 第三节 基因重组与杂交育种 第四节 基因工程 第五节 菌种的衰退,复壮 与保藏,遗传与变异的概述,遗 传：亲代将自身一整套遗传因子传递 给下一 代的行为和功能。 遗传型:一个生物体所含有的基因的总和。 变 异：某一生物体在某种内因或外因的 作用下所引起的的遗传物质结构 和数量的 改变。,一 相关概念,表型：一个生物体所具有的一切 外表特征和内在特性的总和。 饰变：指生物体由于非遗传因 素起的表型改 变，变化发生在转录、转译水 平。特点是几乎整个群体中的每一个个体都 发生同样的变化，性状

2、变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,塞氏杆菌: 在25下培养时，会产生一种深红色的灵杆菌素，把菌落染成鲜红色。可是，当培养在37下时，群体中所有细胞都不产色素。如果重新降温至25，产色素能力又得到恢复。这就是一种饰变。,一、三个经典实验,证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验 肺炎双球菌的转化实验 噬菌体的感染实验 烟草花叶病毒的拆开与重组实验,第一节 遗传变异的物质基础,（一）经典转化实验（transformation）： 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌） S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜 R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙

3、，无荚膜,小白鼠(活),注射活R菌或死S菌,注射活S菌,注射活R菌和热死S菌,（1）动物实验,1928年，Griffith进行了以下几组实验：,小白鼠(活),小白鼠(死),小白鼠(死),活的S菌,抽心血分离,（2）细菌培养实验,热死S菌,活R 菌,热死S菌+活R 菌,不生长,只长出R菌,长出大量R菌和10-6S菌,肺炎链球菌,（3）S型菌的无细胞抽提液试验 活R菌+S菌无细胞抽提液 长出大量R菌和少量S菌,培养皿培养,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状,培养皿培养,培养皿培养,Griffith的转化实验,S,R

4、,加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以 外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty从热 死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的 各种成分，在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将S. Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,(二)噬菌体的感染试验(A. D. Hershey和M. Chase， 1952年),1.标记材料,E.coli,磷源3

5、2PO43-,硫源35SO42-,2.过程,10分钟后,搅动,离心,上清液,沉 淀,用同位素P32的标记DNA,用同位素35标记噬菌体 蛋白质衣壳,3.实验结果,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中 （2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中 所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。,(三)植物病毒重建试验,植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又 可把它们重新组合成具感染性的病毒.,甲乙r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒,乙甲r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒,原始株 拆开 重建 感染 分离纯化,植物病毒的重建实验,（一）核酸存在的七个水平及质粒 细胞水平

6、：存在于细胞核或核质体，单核或多核 细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA 染色体水平: 倍性(真核)和染色体数 核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链 基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译 密码子水平：信息单位,起始和终止, 核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,1、真核生物 染色体: DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染色体有单一线性双链DNA分子; 一个真核生物细胞内有多条染色体; 有间隔子或内含子序列; 没有明显的操纵子结构; 真核细胞核物质外有核膜包围，

7、形成完整细胞核。,二、遗传物质在细胞中的存在,线粒体:真菌线粒体基因组的大小介于动物和植物线粒体基因组之间。 叶绿体：光合生物叶绿体中存在DNA。 真菌的质粒：酵母菌的质粒存在细胞核中。 丝状真菌的质粒存在线粒体中。,染色体: 染色体仅由一条DNA组成，DNA为共价闭合环状双链,DNA不与组蛋白结合； 一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploid）； 无核膜膜包围，只在细胞中央形成核区； 遗传信息的连续性; 功能相关的结构基因组成操纵子结构。,2、原核生物,质粒(plasmid): 定义：原核生物中，除染色体以外，还有能够自主复制的共价闭合环状DNA分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些

8、性状，并非细菌生活必需。,大小：约为2100106Dalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。,性质： 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体的形式存在；,质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制。 具有转移性，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。 对于细菌的生存并不是必要的 功能多样化,如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶

9、类、降解功能等。 具不亲和群性(不同质粒可在同一细胞内共存),1.F因子:又称致育因子或性因子，环状双链DNA，与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、链球菌等细菌中，决定性别。带有F质粒的为雄性菌，能长出性菌毛；无F质粒的为雌性菌，无性菌毛。 2.R因子:编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐性。 由相连的两个DNA片段组成， R因子=抗性转移因子（ RTF ）+抗性决定因子。RTF控制质粒copy数及复制，抗性决定因子带有抗生素或重金属的抗性基因。,几种代表性质粒：,3. Col因子:大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它

10、肠道细菌。其分子量约41048104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。 4. Ti质粒:是一个大型质粒。 5.降解性质粒:只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。XYL（二甲苯）质粒 、NAP（奈）质粒、TOL（甲苯）质粒等。,第二节 微生物基因突变和诱变育种 一、突变的类型与机制概述： 突变：指DNA上的核苷酸顺序发生了稳定的，可遗传的变化。 基因突变：DNA链上一对或少数几对碱基发生改变而引起。 染色体畸变：DNA链的大片段损失。,突变包括,突变机制： 转换：DNA上一个嘌呤被另一个嘌呤或 者一个嘧啶被

11、另一个嘧啶所替代 颠换：DNA上一个嘌呤被一个嘧啶替代 或者一个嘧啶 被另一个嘌呤替代 添加: DNA分子中多了一个或几个碱基，导致编码 aa三联密码发生了改变，从而引起突变。 缺失: DNA分子中少了一个或几个碱基引起突变。 添加,缺失,畸变（染色体大损伤）, 重复, （由X射线等的辐射烷 移位,倒位. 化剂，亚硝酸等引起畸变）:,碱基置换,移码突变,诱发突变,自发突变,基因突变,点突变,1.自发突变,是指生物体在无人工干预的条件下，自然发生 的低频率的突变。,背景辐射和环境因素的影响,微生物自身有害代谢产物的诱变效应,氨基的互变异构效应,环出效应,自发突变的机制：,2.诱发突变,指通过人为

12、的方法.利用物理、化学、生物因 素显剧提高自发突变频率的手段。,诱变剂：凡具有提高突变频率的任何理化因子,紫外线对DNA的损伤,紫外线使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价 结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间 氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱 基间的正常配对，从而引起突变或死亡。在互补 双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成， 就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转 录，并使细胞死亡。,损伤原理,主要作用于嘧啶，形成TT,TC,CC二聚体， 阻碍碱基间的正常配对：,化学诱变,亚硝酸引起DNA的碱基转换,5-BU尿嘧啶引起碱基的转换,（一）突变率,定义1: 每一细胞在每

13、一世代中发生某一性状突变 的几率。突变率为10-8是指该细胞在一亿次细胞 分裂中，会发生一次突变。,定义2：每一单位群体在每一世代中产生突变的突变 株（mutant，即突变型）的数目来表示。如突变率为 10-8一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个 细胞时，即可产生一个突变表型.,突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数,回复突变:,二、基因突变的突变率及特点：,基因突变可分为自发性突变和诱发突变。 （二）特点： 1.不对应性 突变性状与引起突变的原因间无直接对应关系。 2.自发性 可以在没有人为诱变因素下自发发生。 3.稀有性 率是较低和稳定的，一般在 10 -6 10 -9 间 4.独

14、立性 抗某一种药物的突变型细菌往往并不抗另一种药物 5.诱变性 通过诱变剂的作用，可提高自发突变的频率 6.稳定性 产生的新性状也是稳定而可遗传的 7.可逆性 正向突变 回复突变,突变株的表型成因 检出方法 因突变而丧失合成一补充培养基 种或几种生长因子的 能力不能在基本培养 基上生长突变株。 因突变而产生了对某 药物培养基 种化学药物或致死 物理因子的抗性 条件致死突变型 突变后在某种条件下 培养条件改变 可正常生长、繁殖并 实现其表型，而在另 一条件下却无法生长 繁殖的突变型,三、基因突变类型：,营养缺陷型,抗性突变型,突变株的表型成因 检出方法 形态突变型 因突变而产生的个体 形态 或菌

15、落形态的非选择 （常用颜色变化） 性变异 抗原突变型 因突变而引起的抗原 借助于抗原 结构发生改变 抗体反应 产量突变型 因突变而获得的在有 测定产量或 用代谢物产量上高于 其它 原始菌株的突变株 其它突变型： 毒力、糖发酵能力、代谢产物等,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体： 营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys -， bio- 野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 如：lys + ; bio + ; 原养型 ：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生

16、型的表型相同。,营养缺陷型的筛选,与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基,基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）x：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,逐个检出法：,缺陷型的检出：,影印平板培养法,夹层培养法,缺陷型的应用,作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、 研究代谢过程时用作亲本标记； 作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种； 作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,抗生素抗性变异株的筛选：,四、 微生物育种： 自发

17、突变育种 生产育种：选育正向突变的优良的品种 定向培育：积累并选择相应的自发突变株 诱变育种 用物理（X-ray、UV等）化学（吖啶、亚硝酸、碱基类似物）因素诱变育种，获得突变机率提高。,第三节 原核微生物的基因重组 克隆clone 不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖。 基因重组gene recombination 两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型的过程。重组获得的后代具有新的基因组合，表现出不同于亲本的新性状。 转化 原核微生物的基因重组 转导 接合 原生质体融合,1、转化： 遗传转化是指同源或异源的DNA分子（质粒DNA和染色体DNA）

18、被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的基因转移过程。转化后的受体菌称为转化子。被转移的DNA称为转化因子。 转化的条件是：受体菌必须处于感受态才能接受转化因子，感受态既可以是自然的，也可以是人工的。转化因子通常是双链DNA。 感受态：受体菌最容易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态。 转化过程： 受体细胞处于感受态。 外源DNA与感受态细胞结合并被吸收。 外源DNA整合到受体菌中，成为受体菌染色体的一部分。 转染 transfection:指用提纯的病毒核酸去感染其宿主细胞可增殖出一群正常病毒后代的现象。,转 化 示 意 图,2、转导 通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把一个供

19、体细胞的 DNA 片段转移到另一个受体细胞中，并使后者发生遗传变异的过程。 通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞，称为转导子（transductant）。携带供体部分遗传物质（DNA 片段）的噬菌体称为转导噬菌体或转导颗粒。 缺陷噬菌体：带有外源(如细菌)DNA片段而失去了部分自身DNA的噬菌体称为缺陷噬菌体。,(1)普遍转导(generalized transduction) 噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒)，使受体菌实现各 种性状的转导. 完全普遍 性转导 能形成遗 传性稳定 的转导子,裂解循环,(2)流产转导(abortive transduction):在许多获得供

20、体菌DNA片段的受体菌内，如果转导DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达。 能在选择性 培养基平板 上形成微小 菌落是流产 转导的特点。,(3)局限转导(也称专性转导):某些温和噬菌体只能将细菌的少数特定基因转移到受体菌中的现象。 当溶原菌经诱导后，其中极少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产主错误切割，从而把宿主的某些基因（ 前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal和bio ） ，故形成的转导噬菌体通常带有ga1或bio基因 ，当这样的噬菌体侵染另一宿主细菌时，噬菌体 DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体上，使受体菌获得了供体菌的这部分遗传特性，

21、而形成了专性转导子。,噬菌体DNA的不正常切割,缺陷噬菌体（defective phage）:丢失了自身部分基因，并被同等长度的宿主基因所取代的噬菌体称为缺陷噬菌体。如dgal或dbio。 低频转导（low frequancy transduction, LFT）:形成转导子频率很低的转导，通常只有10-4 10-6 。 高频转导（high frequancy transduction, HFT ）:形成转导子的频率很高, 理论上可达 50%。,(4)溶源转变(lysonenic conversion) 当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得

22、了除免疫性以外的新性状的现象。 当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的性状也同时消失。溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的。 溶源转变的典型例子是不产毒素的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae) 菌株在被噬菌体感染而发生溶源化时，会变成产白喉毒素的致病菌株。,3.接合 通过供体菌与受体菌间细胞直接接触而传递大段DNA的过程。 1946年，Lederberg和Tatum的E.coli k12营养缺陷型株混合培养实验中发现。 E.coli k12两个突变株 Bio- Met- The+

23、Leu+ Bio+ Met+ The- Leu- (生)（蛋）（苏）（亮） 两种菌混合培养后， 出现原养菌 （Bio+ Met+ The+ Leu+） 可在基本培养基上生长。,细菌接合现象研究得最清楚的是大肠杆菌。大肠杆菌是有性别分化的。决定它们性别的因子称为F因子(即致育因子或称性质粒)，呈超螺旋状态，具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中去的能力。也可插入(即整合)到染色体组上； 它既可经过接合作用而获得，也可通过一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、丝裂霉素C、硫酸十二酯钠、亚硝基胍、利福平、溴化乙锭、环己亚胺和加热等)的处理，而从细胞中消失。 F因子的分子量为5107。

24、在大肠杆菌中，F因子的DNA含量约占总染色体含量的2%。,(1)F+菌株:含F质粒，细胞表面产生性毛(sex pili)，与F-细胞接合形成2个F+细胞。 (2)F-菌株： 无F质粒， 不产生性 菌毛，可 接受外来 F质粒。,(3)Hfr菌株 高频重组菌株（high frequency recombination） 与F-接合后，重组频率比F+高几百倍。在Hfr细胞中，存在与染色体特定位点相整合的F因子(产生频率约10-5)。当它与F-菌株发生接合时，Hfr染色体在F因子处发生断裂，由环状变成线状。整段线状染色体转移至F-细胞的全过程约需100 min。在转移时，由于断裂发生在F因子中，所以必

25、然要等Hfr的整条染色体组全部转移完成后，F因子才能完全进入F-细胞。但转移过程由于环境因素如震动等影响会使转移中断，所以越在前端的基因，进入的机会就越多，而在末端的F因子很难进入F-细胞中,故在Hfr x F-中出现2个Hfr的机会很少。,(4)F菌株 当Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离其染色体时，可形成游离的携带一小段染色体基因的F因子，特称F因子。携带有F因子的菌株，其性状介于F+与Hfr之间，这就是初生F菌株。初生F菌株与F-菌株接合，可使后者转变成F菌株，这就是次生F菌株，它既获得了F因子，又获得了来自初生F菌株的若干遗传性状。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为F因子转导(

26、F-duction)、性导(sexduction) 。 在次生的F群体中，大约有10%的F因子重新整合到染色体组上，而恢复成Hfr菌。,F 因子的存在方式及其相互关系,细菌染色体,质粒,质粒转移,质粒整合,F质粒的接合转移,F+xF-=2F+,Hfr x F-= Hfr+F-,4.原生质体融合 通过人工的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合并产生重组体的过程称为原生质体融合（protoplast fusion）。 微生物细胞融合的研究开始于1976年。其一般原理和主要过程是：先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入

27、促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子。,原生质体融合操作过程,第四节 真菌的基因重组 一、有性生殖,粗糙脉孢菌的子囊孢子在子囊中的排列有六种方式,AAAAaaaa aaaaAAAA AAaaAAaa aaAAaaAA AAaaaaAA aaAAAAaa,接合型基因座(A或a)与着丝粒之间未发生染色体交换,接合型基因座(A或a)与着丝粒之间发生了染色体交换,粗糙脉孢菌的有性杂交,二、准性生殖 准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式

28、，它可使同种生物不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。 生殖： 准性生殖包括 下面四个过程: 菌丝联结 异核体形成 核配 体细胞交换和 单倍体化四个 阶段。,在准性生殖中,有丝分裂产生非整倍体核,非整倍体核在继续分裂中丢失染色体,导致重组单倍体的发生,在准性生殖中,有丝分裂时杂合二倍体染色体的偶然交换会导致基因重组的发生,准性生殖和有性生殖的比较,比 较项目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分 化 的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体的细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变为单倍

29、体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现，几率低 正常出现，几率高,几种代表性质粒：,1. F因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（r-determinant），RTF为分子量约为1110