微生物遗传育种课件,基因重组与育种演示课件

1、1,第三章 基因重组与育种,引言,基因重组（Gene recombination）：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传个体的方式，称遗传重组（Genetic recombination,2,3,重组与突变的不同点： 突变是指一个细胞的同一个基因组中某一点或某一DNA片段发生的变异；而重组是来自两个细胞的不同基因组间遗传物质交换的结果，重组可在微生物细胞不发生突变的情况下形成新的基因型与表型,4,杂交（Hybridization）:是指不同基因型的亲本个体或细胞（指单细胞生物）交配而产生子代的过程,重组是分子水平上的概念，而杂交是细胞水平上的概念,杂

2、交中必然含有重组，但重组则不限于杂交这一种形式,5,第一节 细菌、放线菌的接合及育种,一、细菌的接合作用,接合（Conjugation）：指供体菌与受体菌的完整细胞经过直接接触而传递大段DNA（包括质粒）遗传信息的现象,6,一）接合现象的发现,1946年，J. Lederberg和E. L. Tatum将来自E.coli K12的两种营养缺陷型菌株混合培养，其遗传标记如图。结果在单独培养的平板上无菌落，而在混合培养的平板上长出了原养型菌落,7,对接合现象的解释,1）可能是细菌接合后发生基因重组的结果； （2）细菌并没有接合，而是交换了DNA（转化）； （3）细菌细胞并没有接合，而是通过培养基交

3、换了养料，即互养； （4）细菌细胞并没有接合，而是亲本细菌发生了回复突变的结果； （5）虽经接合而未发生基因重组，只是形成异核体或杂合二倍体,8,二）接合作用的证明,1、转化作用的排除,由于在报道接合试验结果之前转化实验已经是众所周知，因此有人怀疑该结果是由转化所导致的。1950年，B.D.Davis设计了U形管实验否定了这一推测（见右图,9,2、互养的排除,营养缺陷型细菌通过培养基交换养料而产生的现象称为互养,Lederberg 和 Tatum将培养过一种营养缺陷型细菌的培养基经过灭菌、过滤，然后加入到另一营养缺陷型菌培养物中。即使前一种菌在培养、灭菌、过滤之前曾发生过裂解，也不能是后一种菌

4、产生原养型,10,3、回复突变的排除,若要发生两种突变的回复突变，其几率为1012， 这是不可能的,11,4、异核体和杂合二倍体的排除,异核体和杂合二倍体的遗传性状不稳定，在传代过程中会发生性状分离，但事实恰恰相反，原养型菌落的基因型是稳定的，证明是单倍重组体,12,三）接合的机制,1、接合作用中两菌株性别的存在,Lederberg 和Tatum认为在两个细菌的亲本细胞在接合过程中起同等作用即E.coli 的性系统被认为是同宗配合,1952年，W. Hayes利用Lederberg 和Tatum所做的杂交实验，对（A）MetBio（Sms或Smr）（B）ThrLeuB1 （Smr或Sms）进行

5、研究。结果表明，在杂交期间，两品系所起的作用是不同的，是一种单向异宗配合过程，两品系在获得的同时发生了性别的变化。其中，供体品系相当于雄性，而受体品系相当于雌性,13,2、F因子的存在,1）E.coli 的某些种（如品系A）记为F，带有一个性因子，或致育因子F（fertility factor），而另一个不育型品系记作F，记不带有性因子； （2）杂交F F是可育的，杂交F F是不育的； （3）F因子可以传递，从F到F细菌，但必须通过细胞接触； （4）F因子能够自发丧失，一旦丧失就不再恢复，除非通过另一个F细胞在传递过来。 F细胞经低浓度的吖啶橙处理后丧失F因子，也会偶尔自发地或经紫外线处理丧失

6、,14,3、F因子及F细胞的特性,F是一种可遗传性状，能够自我复制，类似于染色体基因，但不是染色体基因，其转移的频率可高达70以上,F因子是独立于染色体外的小型环状DNA分子，具有自体复制及转移到其他细胞中去的能力。大小约是细菌基因组DNA的2，分子量为6.3 106d、94.5kb。整个基因组编码94个蛋白质，其中13的基因与接合作用有关,15,F因子基因组有三个主要的基因丛，分别负责插入、复制和转移的功能,A. 转移区（Transfer-region）：是一个操纵子，由22个基因组成，33kb，位于F因子结构图的6093kb之间。其中，tra J、A、L、E、N、B、W、V、C、U、F、H

7、这些基因与性菌毛的合成与装配有关；tra Y、Z、M、I、G、D等基因产物与DNA的转移有关；traG和traN的基因产物与细菌结合有关；traS和traT的基因产物与表面排斥有关,16,B. 复制区（replication-region）：位于F因子结构图谱的4049kb，包含一个特异的复制蛋白基因frp（F replication proteins）、决定不相容性基因inc（incompatibility）和一个复制起始点oriV（vegetative origin of replication,17,F因子的主要表现型是细胞表面有性菌毛，即F细胞表面都有性菌毛。F性菌毛分布在大肠杆菌的表

8、面，数目与F因子相当，长度为120um。 性菌毛的功能：A. 是两性细胞接合时转移DNA的通道，又叫性纤毛桥（sex pili bridge）；B. 又是特异phage吸附的部位,18,4、接合时DNA转移的机制,接合时DNA转移的机制目前不详，但可以确定的是：在接合时，性菌毛的存在是必需的,19,四）F因子的三种存在形式,1、 F：F因子在细胞中以游离状态存在。 2、Hfr（high frequency of recombination）: F因子在细胞中以整合状态存在,Hfr与F的异同： （1） F与Hfr均能与F菌株杂交； （2） F与Hfr均能合成细胞表面附属物性菌毛； （3）Hfr菌

9、株总是从F菌株中得到，而F却从未在Hfr菌株中得到过； （4）Hfr经吖啶橙处理后性质不变，而F经吖啶橙处理后失去F因子； （5）Hfr与F杂交后， F性质一般不会变；而F与F杂交后， F变为F,20,3、F ：携带有部分核染色体基因的F 因子，含有F 因子的菌株称为F 菌株,21,五）三种“雄性”菌株与F接合后的结果,由性菌毛将不同接合型的的细菌连在一起，并且在细胞间形成胞质桥（也称接合管）。在形成接合对以后，F菌的F因子进行DNA滚环复制。单链转入F菌，并合成新的互补链,22,Hfr的染色体双链中的一条链在F因子处发生断裂，由环状变为线状，F因子则位于线状单链DNA的末端，整段线状染色体（

10、单链）也以5 末端引导，等速地转移至F细胞,通过接合而获得新性状的受体细胞称为接合子。（conjugant,23,24,Hfr菌株的F因子的反常切除所形成的F因子有两种类型,I 型：包含了染色体一个区域和不完全的F 因子。 II型：带有完整的F因子DNA和位于F因子插入两端的染色体基因,25,26,F 菌的共同特征,1）I 型F 一般携带的基因是Hfr上的末端，这部分基因在Hfr F时是低频转移的，而在F F时却是高频转移的。 （2）II型F 菌使本来转移频率差异悬殊的两部分基因具有相同的频率。 （3）F 菌的最大特点是能构建稳定的部分二倍体,27,F因子转导：通过F 因子的转移而使受体菌改变

11、 它的遗传性状的现象称为F因子转导或 或性因子转导或简称性导（F duction 或 sex duction,拟表型菌：指表型上属于F 而遗传性上仍是F 的菌，也就是说表面没有性菌毛，因而 丧失了表面排斥性,28,29,六）中断杂交实验,原理： 如果人为地中断正在基因转移的杂交对，然后测定受体菌里遗传标记重组频率，就能知道基因连锁情况,30,1957年，E.L.Wollman和F.Jocob设计了中断杂交实验,供体菌Hfr，受体菌F thr leu lac gal azir tonr strr，将大约10倍的F菌和Hfr对数期菌混合，轻轻振荡培养，在不同时间间隔取样，在组织搅拌器中剧烈振荡后，

12、将培养物经适当稀释后，涂布在含链霉素且以葡萄糖作为碳源的基本培养基上进行选择,31,中断杂交实验,32,中断杂交实验的结果： 基因是以ori、thr、leu、azi、ton、lac、gal的顺序连续转移的。在这个实验中，对Hfr菌的条件是，str基因在整个待测顺序的后端，如果strs基因率先进入受体，获得的重组体将在第一次选择性培养基上被str杀死。另外，thr、leu选择性标记应位于前端，如位于后端则无法测序,33,二、放线菌的接合作用,一）放线菌基因重组的发现,1955年，Sermonti夫妇在天兰色链霉菌（streptomyces coelicoler）ISS株中首次发现通过遗传性交换而

13、产生的重组，接着，Hopwood也用S.coelicoler A 3(2)发现了同样的重组,34,二）放线菌的性别,1、三种性别,原始致育型（IF，initial fertility）：相当于E.coli的F 正常致育型（NF，normal fertility）：相当于E.coli的Hfr 超致育型（UF，ultra fertility）：相当于E.coli的F,35,2、认为IF相当于E.coli的F、UF相当于E.coli的F的理由,1）IF以0.3的频率转变为UF，在经uv处理的IF群体中曾经得到作为受体高度可育的UF菌株，这种情况类似于从F菌株中得到F菌株； （2）IFUF杂交中，UF

14、受体菌株全部转变为IF，而染色体基因重组频率大约为104，两者相差万倍。这种情况与F F相似,36,3、认为NF相当于Hfr的理由,1）IF和NF都产生对于UF菌株具有抑制作用的次甲霉素，而UF菌株则不产生这一抗菌素； （2）IF UF杂交子代全部都是IF，这种转变和染色体基因转移无关，但是NF UF杂交则不同，UF转变为NF都伴随着染色体重组； （3）NF菌株来自IF或是IF的杂交子代，与E.coli中的一样,37,三）放线菌的致育因子,经研究发现在S.coelicoler中存在着一种称为Scp1的致育因子。 Scp1和F因子一样也是一种质粒，具有转移性，在自身转移的同时还能够带动染色体进行

15、转移。此外Scp1还带有与产生次甲霉素有关的基因， Scp1属于附加体质粒,38,四）天兰色链霉菌三种致育类型与大肠杆菌的三种致育类型之间的区别,1、大肠杆菌中F F是不育的，但在天兰色链霉菌中UF UF是可育的，只是频率较低，说明还有另外一种致育因子的存在； 2、大肠杆菌中F F或Hfr Hfr杂交的可育性很低，除非使其中一个成为 F的拟表型，但在天兰色链霉菌中NF NF和IF IF杂交中一部分是高度可育的； 3、大肠杆菌中F F的子代都是F 而Hfr F的子代都是F ，但在天兰色链霉菌中IF UF的子代是IF，NF UF的子代也是NF,39,三、采用接合技术育种,Hfr细菌和F细菌接触带来

16、两个细菌细胞的接合和染色体从Hfr细菌向F细菌转移。因此，接合杂交是确定特定基因的粗略位置的有效方法，也是育种的一种手段,一般采用液体接合培养法，在接合时注意通气和选择标记。选择性标记可以用抗性标记，也可以用营养缺陷型,40,第二节 转化与育种,转化（transformation）：受体细胞直接吸收来自供体细胞的离体DNA片段，并通过交换把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细胞的某些遗传性状的现象。获得新性状的受体称为转化子（transformant,转化不是两个细胞的直接接触，而是供体细胞的离体DNA与受体细胞直接接触而转移遗传物质,41,一、转化过程,转化包括两个基本过程,1）从供体菌

17、中提取遗传物质DNA并转移到受体中； （2）供体的遗传物质在受体中的作用,42,43,44,45,46,一）转化DNA的特点,1、转化子的数目与DNA浓度的关系,在一定条件下转化子的数目与转化DNA的浓度成正比,细菌生长量,47,2、DNA片段的大小与转化子数目的关系,对于转化作用来说，转化DNA片段必须具有一定的大小。一般认为，转化DNA片段的大小没有上限，但是在制备转化子过程中，往往人工打断供体DNA分子，获得的片段约107dal（大约10个基因左右）。在受体细胞摄取DNA时，可能还会进一步断裂，所以仅仅有大约0.5的供体基因组能够进入受体细胞,能发生转化作用的核苷酸链至少不低于450bp

18、,48,3、单双链DNA与转化活性的关系,单链DNA的转化活性低，而双链DNA的转化活性高。因而，DNA完整的双链结构对于转化活性来说是必要的,49,4、转化DNA的命运,大量的实验证明，在转化作用中遗传重组是由供体的单链序列取代了受体DNA的单链序列，使受体的DNA标记变成了供体的遗传标记，并恒定表达，遗传给它的后代,50,二）受体细胞的特点,1、受体细胞的感受态,1）概念 只有在某一特定条件下培养的部分细胞才有吸收DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞。这种感受态细胞所处的状态称为感受态（competence,51,2）感受态的特点和影响因素 特点：感受态不是一种透性特征，而是在适当的生长条

19、件下获得的一种生理特征,影响因素： 受菌龄的影响：一般认为感受态出现在细菌生长对数期的后期； 受遗传因素的影响； 受环境条件的影响,52,2、感受态的比例,不同的细菌的感受态的比例是不同的，一般为1020,3、感受态可在细胞间转移,53,4、感受态因子（CF,1963年，R.Pakula 和 W.Walczak 首次从链球菌中分离得到；1972年，Leonard 和 Cale 纯化的一种蛋白质，称为CF。该蛋白质在感受态转移中起作用,在感受态细胞表面存在着一种特定的抗原，而非感受态细胞则没有这种抗原。细菌细胞在特定的时期产生一种感受态因子（CF），CF与膜上的受体结合，刺激核内DNA产生另一个

20、蛋白自溶素（Autolysin），自溶素转运至细胞膜和细胞壁之间的周质内作用于细胞膜，并改变膜的成分，使细胞膜便于DNA的吸收,54,二、转化过程的基因重组及育种,一）转化技术用于基因定位,在转化过程中，两个连锁的基因可以同时转化，但能够同时转化的基因却不一定是连锁的，因为包含这两个基因的DNA片段可以同时被受体细菌所吸收,55,如果a+和b+是连锁的，那么当DNA浓度下降时， a+ b+转化频率的下降与a+或b+的转化频率下降相同；相反，如果a+ 和b+并不连锁，那么a+ b+转化频率下降将远远超过a+ 或b+的转化频率。这是因为在DNA低浓度范围内，转化子的产生与DNA的浓度成正比。当a+

21、 、 b+两个基因位于同一DNA片段上是， a+ b+转化子与DNA浓度成正比的增加；当a+ b+基因分别位于不同的DNA片段上是，在一定的DNA浓度内， a+ b+转化子与DNA浓度的平方成正比。通过这样的实验检测转化基因的连锁情况可以方便的绘制出遗传图谱,56,以trp+和tyr+ DNA作为供体,57,共转指数： 如将DNA加入到受体菌中，会产生、和三种转化子，将型转化子在其中所占的比例称为共转指数（cotransfer index,58,二）转化育种,利用在转化过程中供体菌可将遗传性状传递给受体菌的这种特性，育种工作者可以采用转化的方法达到育种的目的,59,第三节 转导与育种,一、转导

22、的概念,通过完全缺陷或部分缺陷的噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导（transduction）。获得新性状的受体细胞就称为转导子（transductant）。 转导有两种类型，即普遍转导和局限转导,60,二、转导现象的发现及证明,1952年，N.Zinder 和 Lederberg 在研究鼠伤寒沙门氏菌遗传重组时，采用两种营养缺陷型菌,LA2: phe+ trp+ met his LA22: phe trp met+ his,在将两者混合培养后获得了原养型。同时，再将两者放入Davis管中培养时仍出现重组体，这就

23、证明在两株菌之间有一种过滤性因子起作用,61,过滤性因子是噬菌体（phage）的证明,过滤性因子不会因 DNase 处理而失去活性，说明它不是裸露在溶液中的DNA，故可以排除转化作用，另外由于两个菌是隔离培养的因而也可以排除接合作用； 过滤性因子与从溶源性菌分离到的噬菌体P22具有相同大小的质量； 用抗P22的血清或加热处理，使P22的感染性和过滤性因子的功能失活的速率相同； 抗P22的沙门氏菌菌株同时也对过滤性因子表现为抗性,因此可以证明：过滤性因子就是温和型噬菌体P22,62,三、普遍性转导（generalized transduction,通过完全缺陷的phage 对供体菌任何DNA小片

24、段的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导,63,64,65,一）完全普遍转导,噬菌体在进行包装时，有极少数phage（106108）的衣壳将与头部DNA相仿的一小段供体DNA片段误包在内，形成完全不含phage 自身DNA的假噬菌体，这种假噬菌体称为完全缺陷噬菌体,由完全缺陷噬菌体介导的普遍性转导称为完全普遍转导,66,二）流产普遍转导,简称流产转导（abortive transduction）。经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果其外源DNA在体内既不进行交换、整合、复制，也不迅速消失，而进行转录、转译及性状表达，这种现象称为流产转导,流产转导的受体菌可以

25、在选择性培养基上形成微小的菌落,67,四、局限性转导（specialized transduction,指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象,特点：1、只能是个别特定基因； 2、该特定基因由部分缺陷噬菌体携带； 3、缺陷噬菌体是由于在其形成过程中所发生 的低频率“误切”或由于双重溶源菌的裂解而形 成,68,69,局限转导,70,71,一）低频转导（LFT，low frequency transduction,由于宿主染色体上进行不正常的切离的频率极低，因此在裂解物中所含的部分缺陷phage的比例也极低。这种裂解物称为LFT裂解物。LFT裂解物在低

26、m . o . i .情况下感染宿主，可获得极少量的局限转导，这就是低频转导,m . o . i . ： 称作感染复数，是指每一个敏感细胞所能吸附的相应phage的数量,72,二）高频转导（HFT，high frequency transduction,双重溶源菌： 在高m . o . i .情况下，受体菌会同时吸附缺陷型phage和完整phage，并且可以同时整合在受体菌的核染色体组上，这时的受体菌称为双重溶源菌。此时，正常的phage称为助体phage。由双重溶源菌形成的裂解物称为HFT裂解物,高频转导： 用低m . o . i .的HFT裂解物去感染受体细胞，则可高频率的发生局限转导，这

27、就是高频转导,73,五、转导用于基因定位,普遍性转导噬菌体通常可以用于绘制供体菌遗传图谱,应用于基因定位的共转导现象： P1噬菌体的基因组约为染色体长度的2.4，P1噬菌体感染E.coli后可以随意包裹寄主DNA片段，只要这个片段包含的基因座位不超过E.coli遗传图谱的两分钟距离，均可一起被转导，这是一般用接合和转化作用来进行基因定位所难以实现的，对细菌染色体小片段的精细结构十分有用。 两个邻近的基因一起被转导的现象称为共转导（cotransduction,74,当转导的DNA片段进入受体后，与受体同源分子进行重组，当另一个基因的标记被选择时，那么另一个邻近基因的发现频率随着它们二者之间距离

28、的减少而增大，这个频率称为共转导频率（cotransduction frequency）。 用下式表示： F（1dL）3 d为两个基因之间的距离，L是P1基因组或转导片段长度（在遗传图谱上用分钟表示）。 比如：有两个基因的共转导频率是65，L为2分钟（约76kb,这两个基因之间的距离为0.26分钟（约10kb,75,六、转导育种,利用转导法选育目的菌，首要的任务是要获得转导噬菌体,转导噬菌体的获得： 噬菌体侵染供体菌后，在感染末期，少数噬菌体会将供体菌的DNA误认为是它们自己的DNA，并以其外壳蛋白将细菌DNA包围起来，从而形成转导噬菌体,由于细菌DNA的任何部分都可以被包装，因此，要获得目的

29、转导子必须要通过那些选择性标记,76,转导育种的过程,操作过程如下： 先将供体菌培养至对数生长期，然后向其中加入噬菌体，继续培养是一部分供体菌发生裂解反应而释放出转导噬菌体。加入氯仿以杀死仍活着的供体菌，待完全溶菌后低速离心以除去菌体残渣，上清液经Dnase处理和微孔滤膜除菌后，即制成供体菌裂解液。 将受体菌培养至对数生长期，向其中加入供体菌裂解液，待转导噬菌体吸附后，低速离心收集菌体。将该菌体转移到选择培养基平板上，培养即可从中获得目的转导子,首先要进行噬菌体效价的测定。所谓噬菌体效价就是1ml培养液中含有活噬菌体的数目,77,第四节 微生物原生质体融合和育种,一、原生质体融合的概念,所谓原

30、生质体融合，就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之成为原生质体。然后在高渗的条件下混合，并加入物理的、化学的、生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集。通过细胞质融合、核融合，而后发生基因组间的交换、重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程,78,狭义的原生质体（protoplast）即细胞壁被彻底酶解完全 脱壁后形成的 1、原生质体 广义的原生质体既包括狭义的原生质体也包括不完全脱 壁后形成的圆球体（spheroplast,物理的 ：瞬时高压的交变电场或激光等 2、助融条件 化学的：聚乙二醇、二甲亚砜、伴刀豆球蛋白A、磷 脂酰丝氨酸、溶血卵磷脂

31、等 生物的：仙台病毒、鸡新城疫病毒、等,关于原生质体概念的解释,79,二、原生质体融合在生物工程中的地位,生物工程 （biotechnology,细胞工程,基因工程,酶工程,发酵工程,固定化细胞,基因体外重组,染色体移植或引入,细胞器移植,核移植,固定化酶,酶分子的改造和修饰,发酵自动化,产品后处理,泛指遗传工程,组织培养,原生质体融合,80,1、原生质体融合是一种更为广泛，更为随机的基因重组方式； 2、原生质体融合方式，可以打破微生物的种属界限，实现远缘菌株间的基因重组； 3、原生质体融合可以使遗传物质传递更为完全，可以获得更多基因重组的机会，有利于提高育种速度； 4、借助融合剂可同时将几个

32、亲本的原生质体随即融合在一起，从而获得综合几个亲本性状的重组体，加速育种进程； 5、原生质体融合可以和其它育种方法相结合，把从其它方法得到的优良性状通过原生质体融合在组合到一个单株中，提高菌株产量的几率增大,三、原生质体融合及原生质体技术的理论与实践意义,81,6、原生质体融合可以大大提高遗传重组的频率； 7、在生产菌种的选育中，可以应用具有较高产量性状的菌株作为融合时出发菌株，以期达到理想育种的目的； 8、可以应用灭活的原生质体进行融合，从而提高筛选效率，省去育种过程中对亲株的遗传标记，省去人力、物力和时间，也可防止因增加标记而降低出发菌株的产量； 9、原生质体技术有助于建立工业微生物的转化

33、体系，开辟新的育种途径； 10、对微生物制备原生质体后直接再生育种、原生质体诱变后再生育种、原生质体转化育种、原生质体转导育种、原生质体固定化等原生质体技术在微生物育种与工业生产中近年来已日趋广泛开展； 11、在理论上，微生物的原生质体融合可用于研究噬菌体与寄主间的关系，深入了解溶源机理及免疫因子和存在部位；研究原噬菌体的DNA在寄主染色体上的结合位点,82,12、在细胞学研究方面，通过原生质体融合，有助于研究核质关系及细胞质遗传问题； 13、微生物原生质体融合，可用于遗传性分析等理论研究,83,1）标记菌株的筛选； （2）原生质体的制备； （3）原生质体的再生； （4）原生质体的融合； （5

34、）融合子的选择； （6）实用型菌株的筛选,四、原生质体融合育种的基本程序,原生质体融合一般包括如下步骤,84,细胞原生质体融合程序示意图,85,一）标记菌株的筛选 在原生质体融合过程中，为了便于筛选，通常对于所用的亲株都要进行一定的遗传标记。 一般可以采用营养缺陷标记和抗药性标记,86,二）原生质体的制备 在细菌和放线菌中主要采用溶菌酶； 在酵母菌和霉菌中一般可用蜗牛酶和纤维素酶,87,影响原生质体制备的因素 1、菌体的预处理 为了使酶的作用效果更好一些，可对菌体进行预处理，包括菌体培养阶段的预处理和酶解前的预处理。 对于细菌可加入甘氨酸、青霉素和D环丝氨酸等，对于放线菌可以使用甘氨酸（14）

35、等，在酵母菌中加入EDTA和巯基乙醇等,88,2、菌体的培养时间 为了使菌体易于原生质体化，一般选择对数生长期的菌体。 一般对于细菌采用对数生长期后期为好，对于放线菌采用对数生长期与稳定期之间的转换期最为合适,89,3、酶浓度 一般来讲，酶浓度增加，原生质体形成率增加，但是超过一定范围，则原生质体形成率增加的效果不明显；酶浓度过低，则导致原生质体再生率下降。 通常，采用当原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最佳酶浓度,90,4、酶解温度 温度对酶解作用有双重影响。一方面，随着温度的提高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度的增加，酶蛋白逐渐变性而失活。因此，最适温度是这两方面的共同结果。 一般在选择最佳温度时，除了考虑酶的最适温度外，还要以原生质体再生率加以校正,91,5、酶解时间 原生质体的制备质量与酶解时间有密切的关系。酶解时间过短，原生质体形成不完全，结果会影响到融合；酶解时间过长，原生质体脱壁太完全，原生质体的质膜也会受到损伤，从而会影响到再生，最终也不利于融合。 因此，选择一个最适的酶解时间对于原生质体融合是非常重要的,92,6、原生质体制备液（渗透压稳定剂） 高渗透压在原生质体制备中不仅起到保护原生质体免于膨胀作用，而且有助于酶与底物的