酶抑制剂及反应动力学【参考仅供】

1、酶工程,主讲:阮丽芳 生命科学技术学院 农业微生物国家重点试验室 ,1,医学参考A,第二章 酶抑制剂及反应动力学,第一节 酶抑制作用的概念和分类,一 概念 二 抑制程度的表示 三 抑制作用的分类 四 抑制作用的定义,1. 失活作用 2. 抑制作用 3. 去激活作用 4. 阻遏作用,一 概念：能降低酶催化反应速度的因素,1. 失活作用,失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。,2. 抑制作用,抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。,3. 去激活作用,去激活作用，某些酶只

2、有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失。去激活作用通过去除金属离子而间接地影响酶的活性。当金属离子去除后，底物与酶的结合减少，实际上是降低了底物的有效浓度。,4. 阻遏作用,阻遏作用指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化，而抑制作用是指一定量酶分子催化效力的减少，不涉及酶分子合成的问题。,二抑制程度的表示,二抑制程度的表示,一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑 制剂时的反应速度为 Vo，加入抑制剂后的反 应速度为Vi，则酶的抑制程度有下列几种表 示方法：,二抑制程度的表示,1 相对

3、活力分数（残余活力分数） a=Vi/Vo 2 相对活力百分数（残余活力百分数） a%=Vi/Vo*100% 3 抑制分数 指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo 4 抑制百分数 i%=(1-a)*100%=(1-Vi/Vo)*100% 通常所谓抑制率是指抑制分数或 抑制百分数。,三. 抑制作用的分类,不可逆抑制作用（非专一性不可逆抑制作用；专一性不可逆抑制作用） 可逆抑制作用（竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用，反竞争性抑制作用，混合型抑制）,四. 抑制作用的定义,不可逆抑制作用 抑制剂与酶分子上的某必需基团以共价键结合，使酶失活，不能用透析、过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。,三

4、. 抑制作用的分类,四. 抑制作用的定义,有些不可逆抑制剂能与酶分子中一类或几类基团反应，称为非专一性不可逆抑制剂。 重金属离子：共价结合巯基、氨基和吲哚基，从而使酶失活。,四. 抑制作用的定义,Ks型不可逆抑制剂：根据底物的化学结构而设计的抑制剂，具有和底物类似的结构，可以和相应的酶相结合，同时所带活泼化学基团化学修饰酶分子中必需基团从而抑制酶的活性。这种抑制剂是通过其对酶的亲和力而对酶进行修饰标记的，所以又称亲和标记试剂。,Kcat（catalyze)型不可逆抑制剂(自杀性底物)：具有与天然底物相类似的结构，本身也是酶的底物，被酶催化后，潜伏性的反应基团因酶的催化而暴露或活化，作用于酶的活

5、性中心或辅基，使酶被共价修饰而失活。 E +Ss ESs EI,自杀性底物,克拉维酸在抑制内酰 胺酶的过程中，既为酶 的底物又为酶的抑制剂, 当每一个酶分子被不可 逆的钝化，约有115个 克拉维酸分子作为底物 被破坏。,三. 抑制作用的分类,四. 抑制作用的定义,抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活者称为可逆抑制作用。 动画,五 可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别,1.物理方法 用透析、超滤和凝胶过滤等方法是否能除去抑制剂来鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用。 2.动力学方法 在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，测定酶反应的初速度，以初速度和酶浓

6、度作图。,四. 抑制作用的定义,第二节 酶抑制剂及其应用,一 概述 酶抑制剂（Enzyme inhibitor)：使酶活性降低乃至完全丧失活性的配体。 IC50：酶的活性抑制50%时所需的酶抑制剂浓度。,二 酶抑制剂的应用,保健药物,美容药物,农用药物,医药领域的应用,二氢叶酸合成酶 对氨基苯甲酸 二氢叶酸 四氢叶酸,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸还原酶,转肽基酶,痛风病药物作用机理,一些药物对酶的抑制效应,一些药物对酶的抑制效应,酪氨酸酶（微生物产黑色素的关键酶）,L-多巴（DOPA）,黑色素,酪氨酸酶抑制剂（曲酸）,酪氨酸,肉毒素的小分子抑制剂 肉毒素是由两个肽链构成的，一个重链和一个轻链。重链

7、靶向并结合到神经末梢的表面受体。这样肉毒素就可进入神经末梢内部。一旦进入，轻链就与重链分离，切断控制神经肌肉功能的特异蛋白。这些蛋白的破坏有效阻止了引起肌肉收缩的神经递质的释放，而肌肉收缩是呼吸所必需的。肉毒素侵入神经末梢的结果就是导致瘫痪，最终导致窒息和死亡。,农业领域,胆碱酯酶:胆碱酯酶催化胆碱酯生成乙酰胆碱（神经系统受体），缺乏受体造成昆虫神经系统紊乱，痉挛而死。,构建抗除草剂工程植物机理（1）提高除草剂作用靶酶的剂量,EPSP合成酶的生理作用与草甘膦的抑制作用 EPSP合成酶: 5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶 EPSP合成酶是芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关

8、键酶，芳香族氨基酸参与植物体内一些生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、酚类物质等的次生代谢。 EPSP 芳香族氨基酸 重要物质次生代谢 草甘膦施用后被植物迅速吸收，并随同化产物传导至整个植株，因其阻断了芳香族氨基酸的生物合成，对植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢过程产生影响而导致植物死亡（竞争抑制，非选择性）。,植物5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶的cDNA克隆 连接CaMV启动子，通过Ti质粒载体导入矮牵牛 目前已将这种修饰过的基因导入烟草和矮牵牛，并产生了抗性（竞争抑制，非选择性）,构建抗除草剂工程植物机理（2）引入除草剂钝化酶,谷氨酰胺合成酶(GS)及其抑制剂膦丝菌素

9、GS的生理功能及酶学特征 谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase(GS)，催化无机氮向有机氮的转化反应，植物体中的GS是将氨固定到有机物当中。 膦丝菌素（ PPT ）的抑制机理 无机氮 GS 有机氮,PPT-CoA,Bar,从链霉菌中克隆编码使膦丝菌素乙酰化而失活的酶的基因 连接CaMV启动子，并将其转化到土豆 Bar基因，能合成乙酰转移酶，解除非选择性除草剂PPT对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。目前已将这个基因导入小麦、烟草、马铃薯、甜菜等作物，其中转基因马铃薯已进行大田试验并取得良好效果。,构建抗除草剂工程植物机理（3）降低植物作用靶酶对除草剂的敏

10、感性,突变avoA基因，它合成的EPSP酶的脯氨酸被丝氨酸所取代，酶的活力不受影响，但是对非选择性除草剂草甘膦的结合力只有原来的25%，从而使植物对除草剂表现不敏感。,三 酶制剂的制备,1产酶抑制剂的微生物 优势：毒性小，针对性强适合治疗 来源广泛，种类多 适合大规模生产 微生物体内，两者共存，为寻找 酶制剂指明方向,2组合化学法 基于化学合成与计算机技术相结合的组合化学法是酶抑制剂筛选的全新方法,其基本原理是借助组合合成仪同时合成出大量不同化合物,并通过高通量群集筛选技术得到最有潜力的先导物.,3高通量筛选法 高通量筛选法是在传统筛选技术的基础上,将先进的分子生物学,细胞生物学,计算机,自动

11、化控制等多种技术方法有机结合而形成的,更适合酶抑制剂筛选的技术体系,目前已经用于新药的筛选.,一 高通量筛选(High Throughput Screening) 靶标(酶),测试多种化合物,对靶标产生预想结果的化合物(Hit),先导物,目的物,四 酶抑制剂的筛选,二 建立筛选模型 分子水平的药物筛选模型:受体筛选;酶筛选;离子通道筛选. 细胞水平药物筛选模型:细胞调亡;转录调控;信号传导;细菌生长;细菌蛋白分泌,第三节 有抑制的酶反应动力学,一：双曲线：1902年，研究蔗糖酶催化蔗糖水解反应 第一段：一级反应 反应速度只与反应物浓度一次方成正比 第二段：混合反应 第三段：零级反应 反应速度与

12、反应物浓度无关,米-曼模式使用如下的酶催化概念 E+S ES E+P 米-曼推导公式描述出实验观察的结果. V0=VmaxS/（Km+S） 米-曼在推导此公式时,规定一新的常数即 Km,称为米氏常数(单位:mol/L) Km=(K-1+K2)/K1,k1,K-1,k2,二：双倒数做图（Lineweaver-Burk） 双倒数图是测定抑制剂如何与酶结合的有用方法,1竞争性抑制动力学 若在反应体系中存在有与底物结构相类似的物质，该物质能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。这种抑制称为竞争性抑制。 例1：底物类似物 二氢叶酸合成酶 ：对氨基苯甲酸二氢叶酸 其竞

13、争性抑制剂：对氨基苯磺酸,反应式 E+S ES E+P + I EI,Ks,k2,Ki,Vo=VmS/( Km+S) animation = 1+I/Ki Ki=EI/EI （ 1/Vo =Y） Y = KmX/Vm（1/S=X） +1/Vm 1）当I=0， = 1， 当X=0时，在Y轴上的截距为 1/Vm， 当Y=0时，在X轴上的截距为 -1/ Km 2）假设I= Ki， = 2， 当X=0时，在Y轴上的截距为 1/Vm， 当Y=0时，在X轴上的截距为 -1/ 2Km 3）假设I= 3Ki， = 4，,竞争性抑制动力学的主要特点是增大米氏常数(即亲和力下降)，即当I 增加，或KI减小，都将使

14、KmI增大，反应速率下降，但Vm不变,因为可以通过增加底物浓度解除抑制。 V0：抑制后反应速度 Km：米氏常数 Ki：抑制常数（酶抑制剂复合物解离常数） KmI：加入抑制剂后的米氏常数,2、反竞争性抑制,抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物ES相结合生成ESI复合物。,反应式 E+S ES E+P + I ESI,Ks,k2,Ki,动力学方程： Vo=VmS/(Km+ S) = 1+I/Ki Ki=ESI/ESI Y= KmX/Vm+ / Vm 1）当I=0， = 1， 当X=0时，在Y轴上的截距为 1/Vm， 当Y=0时，在X轴上的截距为 -1/ Km 2）假设I= 0.5Ki， =

15、 1.5， 当X=0时，在Y轴上的截距为 1.5/Vm， 当Y=0时，在X轴上的截距为 1.5/ Km 动画,反竞争性抑制使得Vm下降，Km下降，下降倍数为= (1+I/Ki)。,3非竞争性抑制动力学或线性混合型抑制作用,若抑制剂在酶的底物结合部位以外的必需基团与酶相结合，并且这种结合与底物的结合没有竞争关系，这种抑制称为非竞争性抑制或线性混合型抑制作用。,反应式 E+S ES E+P + + I I EI+S ESI Ki：EI复合物或EIS复合物的解离常数(非竞争性抑 制常数) Ks：ES复合物或EIS复合物的解离常数,Ks,k2,Ks,Ki,Ki,线性混合型抑制基本上与非竞争性抑制相似。

16、但由于I和E的结合改变了底物的解离常数Ks，S与E的结合改变了抑制剂从复合物上解离的常数Ki。（KsKs，KiKi）,动力学方程： Vo=VmS/( Km+ S) =1+I/Ki = 1+I/Ki Ki=EI/EI Ki=ESI/ESI Y= KmX/Vm+ / Vm,1）当I=0，略 2）假设I= 0.5Ki=0.25Ki(Ki Ki) 当X=0时，在Y轴上的截距为 /Vm， 当Y=0时，在X轴上的截距为 - / Km ( / 1),Ki Ki? Vm下降,KmI减小,非竞争与反竞争混合,相交于第三相限 当KiKi时， =,为非竞争性抑剂; ； 当Ki时， =1,为竞争性抑制； 当Ki时，

17、=1,为反竞争性抑制; 当Ki Ki且均为常数值时为线性混合抑制。 若无ESI存在，则为竞争性抑制；若无EI存在，且ESI无反应活性，则为反竞争性抑制；若E和底物的结合并不能影响E和I的结合，且ESI无反应活性，则为非竞争性抑制。,1）当I=0， = 1， 略 2）假设I= Ki， = = 2， 当X=0时，在Y轴上的截距为 2/Vm， 当Y=0时，在X轴上的截距为 -1/ Km 非竞争性抑制，使最大反应速率下降，下降倍数为= (1+I/Ki )， Km不变。,4底物抑制动力学,由于底物浓度增大而引起反应速率下降的作用，称为底物抑制作用。 E+S ES E+P + S ES2 ES2为不具有催

18、化反应活性，不能分解为产物的三元复合物。,k1,k2,Ksi,k-1,动力学方程： Vo=VmS/(Km+ S) = 1+S/Ksi Ksi=ESS/ES2底物抑制解离常数 Y= KmX/Vm+ / Vm 在低底物浓度,S/Ksi1, =1,无底物抑制作用 Vo=VmS/(Km+ S) 1/V-1/S做图为一条直线 在高底物浓度, 有底物抑制作用 1/Vo= (Km+ S) / VmS = Km/ VmS+ / Vm = / Vm = 1/ Vm+ S/Ksi Vm 1/V-S做图为一条直线,5.产物(反馈）抑制,产物与酶形成复合物EP后，就停止继续进行反应。 E+S ES E+P + P E

19、P+S EP为无活性的端点复合物 动力学方程： Vo=VmS/( Km+ S) = 1+P/KP I是变量以P表示,例题 1,在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物并测定其初始速度，然后再在同样五个反应物系中分别加入浓度为2.210-1mmol/L的抑制剂，并测其初始的反应速率，其数据见下表。,试根据上述数据决定其抑制类型及动力学参数值Ki。 解：以LB作图法来判断抑制，类型并求其参数。将上述实验数据分别取其倒数，以1V对1S作图得到下图所示两条直线，它们在纵轴上有一公共交点，这表明该抑制为竞争性抑制。 根据图可得 Vm=100mmol/(L.min) Km=0.24mmol/L Km=0.44 求得Ki=0.27mmol/L,幻灯片 58,例题 2,某酶的Km值为4.710-5mol/L，如果vm值为2.21