微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展_张昕欣_pdf

1、化工进展392CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS2012年第 31卷第 2期进展与述评微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展张昕欣 1，吴翰桂 1，奚立民 1，王玲萍 2（1台州职业技术学院生物与化学工程系，浙江台州 318000；2浙江海正药业股份有限公司，浙江台州 318000）摘 要：微生物发酵生产紫杉醇由于其环境友好、工艺简单、成本低廉的优势，近年来被认为是解决紫杉醇生产原料来源危机的良好方法。由于单位发酵液中紫杉醇产量太低，迄今为止尚没有一株可以进行工业化生产的产紫杉醇菌株问世。本文就微生物发酵法生产紫杉醇的研究现状进行了总结分析，主要包括

2、紫杉醇产生菌的筛选、发酵培养基的优化、微生物体内紫杉醇合成相关酶基因的克隆及产紫杉醇菌种的改良。关键词：紫杉醇产生菌；培养基优化；菌种改良中图分类号：Q 939.79文献标志码：A文章编号：10006613（2012）02039205Recent research and prospect on microbial producing taxol ZHANG Xinxin1，WU Hangui1，XI Limin1，WANG Lingping2（1 Departement of Biological and Chemical Engineering，Taizhou Technical Coll

3、ege，Taizhou 318000，Zhejiang，China；2Hisun Pharmaceutical Co. Ltd.，Taizhou 318000，Zhejiang，China）Abstract： For its environmentally acceptable， relatively simple and inexpensive features，microor-ganisms fermentation has been investigated as a potential alternatives to solve the crisis of rawmaterial. N

4、o commercial fermentation strain has been used so far，because of the low production. Theaim of this study is to review and analysis the present status of research on paclitaxel-producing bymicroorganisms，screening of paclitaxel-producing microorganisms，optimization of the culturemedium，genes of the

5、paclitaxel biosynthesis and improvement of the taxol-producing microorganisms.Key words：taxol-producing microorganisms；optimization of the culture medium；improvement ofstrain紫杉醇（taxol）是在 20世纪 60年代早期从太平洋紫杉中分离出来的一种二萜类生物碱（图 1），经研究发现其具有广泛的抗癌活性1。自 1993年第一株产紫杉醇真菌被发现并报道后 1，微生物发酵法生产紫杉醇逐渐被认为是一种环境友好、成本低获得能够适用

6、于发酵生产的工业菌株是实现发酵生产紫杉醇的前提，但是目前已知的微生物生产紫杉醇产量很低，不能够满足产业化生产要求（产率高于 1 mg/L）4，需要进行一系列的优化改良。主要通过以下两个途径来解决：一是从自然界中继续寻找更适合发酵的原始菌株；二是对现有的菌株进行遗传改造，提高其发酵紫杉醇产率。目前报道的产紫杉醇菌株主要是红豆杉内生菌 5，人工培养时菌体往往生长缓慢，从而影响其最终紫杉醇的产量；因此新菌株的筛选与现有菌株的遗传改造都需廉的解决紫杉醇生产原料来源危机的方法2-3。收稿日期：2011-08-03；修改稿日期：2011-09-16。基金项目：台州市科技计划项目（092KY01）。第一作者

7、及联系人：张昕欣（1980），女，讲师，主要从事微生物药物方面的研究。E-mail 。图 1紫杉醇的化学结构第 2期张昕欣等：微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展393要进行更深入的研究。因的部分编码序列被报道用做探针，检测菌株是否具有合成紫杉醇的潜力13-15。Zhou122007年报道，分别以待检的 38株菌株的基因组序列为模板，利用ts基因特异性引物作 PCR。经后续检测，PCR结果为阳性的 12株菌株中，有 3株为明显产紫杉醇的菌1 紫杉醇产生菌的鉴定筛选自从短叶红豆杉（ Taxus brevifolia）中分离到第一株产紫杉醇的内生真菌 Taxo

8、myces andreanae后6-7，至 2010年，已有近百株产紫杉醇的菌种被分离鉴定出来，其中，超过 80%为真菌，其余为细菌和放线菌5。据报道，除一株异角状拟盘多毛孢（Pestalotia heterocornis）采自红豆杉树林的泥土中外8，其余菌株皆为采自红豆杉及其相近种属的植物内生菌。经鉴定，这些已报道的产紫杉醇内生真菌大都属于真菌中的子囊菌纲和半知菌纲 5。在产紫杉醇菌种筛选过程中，除传统的分离菌种，利用色谱、质谱、核磁共振等方法鉴定菌种产物结构的工作外，还有酶联免疫法及分子探针法两种高通量的筛选方法被引入了紫杉醇产生菌的初筛鉴定中。13-15的研究结果也株。Miao、Kuma

9、ran、Zhang等14利用 dbat部证实了这种方法的可行性。Miao等分序列作探针，确定了其课题组从中国红豆杉中获得的几十株内生真菌中的 4株具有合成紫杉醇的能13力。2009年，Kumaran等利用 TS的基因中的保守区部分序列作探针，对 3株高产紫杉醇真菌进行检测，结果全部都呈阳性。该结果进一步证实了利用 ts的部分序列作探针，进行紫杉醇产生菌筛选的15可行性。Zhang等利用 BAPT和 DBAT的部分编码序列作探针，从近百株植物内生菌中筛选得到了3株产紫杉醇的菌株。Zhang称，dbat、bapt作为探针所获的菌株初筛结果将更为准确可靠。由于此种方法是对待筛菌株的紫杉醇合成途径中相

10、关酶类的基因进行检测，得到的结果只能作为菌株是否能够产生紫杉醇的依据；因此更适用于原始采集株的初筛，不适用于产紫杉醇菌株诱变后高产量菌株的筛选。1.1 酶联免疫吸附法20世纪 90年代已有抗紫杉醇抗体被纯化制备的报道9，现今商业化的紫杉醇免疫试剂盒已在出售。2000年，Caruso10利用此方法从 221株原始采集株中获得了 15株产紫杉醇真菌、10株产紫杉醇放线菌。经后续鉴定检测，这些菌株发酵液中紫杉醇的含量在 10100 ng/L不等，可见这种利用含有抗紫杉醇抗体的酶联免疫试剂盒来检测不同采集菌种的液体培养基中紫杉醇的含量，以此来对原始采集株进行初筛的方法具有较高的准确度和灵敏度。此外，在

11、树状多节孢（Nodulisporium sylviforme）原生质体诱变实验中发现：随着突变株对制霉菌素抗性的提高，其紫杉醇产量也随着相应地提高，但其机理并不清楚16。因此推测，若已知某产紫杉醇菌种体内某些抗生素抗性基因与紫杉醇合成某一相关基因存在相互的调控影响，则该特性可被用于产紫杉醇菌株诱变后高产量菌株的初筛。Li等11也有类似报道，利用特定的抗紫杉醇抗体，对落羽杉（Taxodium distichum）中分离得到的内生菌培养物进行检测，筛选得到了紫杉醇产生菌。鉴于其对菌株培养物中紫杉醇的含量具有较高的灵敏度，酶联免疫吸附法既可用于原始采集株的初筛，也可以用于产紫杉醇菌株诱变后高产量菌株

12、的筛选。2产紫杉醇微生物的发酵培养基优化目前关于真菌产紫杉醇发酵条件的研究报道不是很多。可以肯定的是，由于植物内生真菌脱离其宿主体后次生代谢会停止或延缓，因此在产紫杉醇内生真菌的发酵液中加入红豆杉针叶提取物，可以提高紫杉醇的产量4。另外，培养基中其它一些影响紫杉醇代谢途径的物质的加入也会影响紫杉醇的最终产量。1.2 关键酶基因部分序列作分子探针迄今已有紫杉二烯合成酶（taxadiene synthase，TS；其相应的编码基因 ts）、3-氨基-3-苯基丙酰转移酶（ C-13phenylpropanoylsidechain-CoAacyltransferase，BAPT；其相应的编码基因 ba

13、pt）、脱乙酰巴卡亭 -10-O乙酰转移酶（ 10-deacetylbaccatinIII-10-O-acetyltransferase，DBAT；其相应的编码基因 dbat）3种紫杉醇合成途径中的关键酶基2.1 代谢途径的诱导物提供紫杉醇代谢途径的诱导物可以帮助启动紫杉醇的合成，提高其产量。例如，在小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）发酵液中加入394化工进展2012年第 31卷适当的 Mn2+、Mg2+、Zn2+离子有助于紫杉醇的积累17。但是在不同菌株不同发酵条件的情况下，由于大多产紫杉醇菌株为植物内生菌，因此某些植物生长调节剂会对其产紫杉醇有一定的调节作

14、用。例如，植物光合作用促进剂氯化氯胆碱（Chlorocholine chloride，CCC）对于内生真菌产紫杉醇有抑制作用；而促进花芽形成的 N-二甲氨基琥珀酸（N-dimethylamino succinic acid）对其有提高产微生物生理代谢所需营养物质会有很大不同，而且紫杉醇的代谢途径会有所差异，所以这些添加物的成分很难确定，具有针对性的研究还有待于深入进行。量的作用6，20。2.2 代谢合成的前体研究产紫杉醇内生真菌的代谢机理和紫杉醇的合成机制，进而找到其代谢合成的前体，并且将这些前体有目的地加入紫杉醇发酵液中，能够进一3微生物体内紫杉醇代谢途径相关基因的克隆与应用步提高其产量。根

15、据 Eisenreich等18的研究，紫杉紫杉醇的生物合成大约要经过 19个酶促反应醇分子的双萜类母核合成所用的异戊二烯是由葡萄糖的初级代谢产物磷酸丙糖与丙酮酸脱羧产物二碳单位缩合进而分子内重排后产生的。因此，产紫杉步骤21-23。合成起始物为一种常见的二萜前体牛儿基牦牛儿基焦磷酸（ geranylgeranyl diphosphate，GGPP），GGPP经 TS催化环化生成紫杉二烯醇菌的发酵过程中应尽量地使用以葡萄糖为碳源的taxa-4(5),11(12)-diene22-23。紫杉二烯经官能化反培养基。Fleming等19证实紫杉醇的 C13侧链是由苯应后生成 10-脱乙酰巴卡亭（10-

16、deacetyl-baccatinIII），进而经过酰化酯化反应丙氨酸 C2位羟基化和氮原子的酰基化作用而形成，故在发酵过程中，应考虑添加苯丙氨酸提高紫杉醇的含量。生成紫杉醇（图 1）24-25。这些结论主要来自于对2.3 竞争性代谢途径抑制剂植物体内紫杉醇合成途径的研究，微生物相关的代谢研究则较少。目前已报道从产紫杉醇微生物体内克隆得到的紫杉醇代谢途径相关基因序列除紫杉二烯合成酶的编码基因 ts外，还有参与催化紫杉二烯生成 10-脱乙酰巴卡亭的 3-氨基-3-苯基丙酰转移酶基因 bapt以及参与催化巴卡亭生成紫杉醇的脱乙酰巴卡亭-10-O乙酰转移酶基因 dbat，具体Li等20在研究小孢拟盘

17、多毛孢发酵生产紫杉醇时发现，麦角固醇的合成会竞争紫杉醇合成的前体，进而证实小孢拟盘多毛孢发酵液中如果有甾醇类物质合成途径的抑制剂的加入，会提高紫杉醇的积累量。其中，以戊唑醇和三唑酮的效果最为明显，分别可以将紫杉醇的积累量提高 50倍和 25倍，但由于二者在发酵液中的存在会影响小孢拟盘多毛孢菌丝体的生长，所以在发酵开始 810天后加入效果最佳。由此可见，寻找产紫杉醇菌株体内与紫杉醇合成存在竞争关系的物质合成途径，并对其加以抑制，则可以显著提高紫杉醇的发酵产率。情况如表 1所示12-14，26-29。4改良产紫杉醇菌种的方法与应用通过利用各种生物工程技术，对产生紫杉醇的菌株进行遗传改造，进而构建高

18、产紫杉醇内生真菌表 1 微生物体内紫杉醇合成相关途径基因序列基因来源序列大小、完整性植物寄主ts鲁氏毛霉（Mucor rouxianus）枝状枝孢酶632 bp，部分序列中国红豆杉（Taxus chinensis）dbatdbatbapt1546 bp，完整序列1545 bp，完整序列未知曼地亚红豆杉（Taxus media）曼地亚红豆杉（Taxus media）短叶红豆杉（Taxus brevifolia）（Cladosporium cladosporioides）亮白曲霉（Aspergillus candidus）安氏紫杉菌（Taxomyces andreanae）第 2期张昕欣等：微生物

19、发酵法生产紫杉醇的研究进展395的工程菌株，是微生物发酵法生产紫杉醇可以工业化应用的主要途径。目前已有原生质体诱变技术、基因改组技术（gene shuffling）、相关酶基因的异源表达等方法被应用。些早期研究结果虽然只获得了具有体外催化活性的相关酶蛋白，但为后续的紫杉醇合成相关酶类的异源宿主体内表达提供了一定基础。2001年，Huang等35的研究表明，在大肠杆菌中同时表达红豆杉的异戊烯二磷酸异构酶（isopentenyl diphosphate isomerase）GGPP合成酶、TS会有紫杉二烯产生，产量可达到每升发酵液 1.3mg。由此，证实了在不产生紫杉醇的异源宿主中表达、生产紫杉醇

20、的可行性。另有报道在酿酒酵母中同时表达来源于中国红豆杉和嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）的紫杉醇合成相关途径4.1 原生质体诱变微生物诱变育种目前仍是发酵工业的菌种选育的主要办法，国内外发酵工业中采用的各种生产菌大多是诱变所得。对产紫杉醇的内生真菌进行原生质体诱变，也是获得可能的工业化紫杉醇生产菌株的一个主要办法。例如，赵凯等16报道：对紫杉醇产生菌树状多节孢的原生质体进行了紫外线和氯化锂复合诱变，其紫杉醇产量从出发菌株的 314.07g/L提高至 418.24 g/L。酶类基因，紫杉醇产量可达到 8700 ng/L36；在酿酒酵母中表达来源于安氏紫杉菌紫杉

21、醇合成相关途径酶类基因，紫杉醇产量为 1000 ng/L26。由此可见，4.2 基因改组技术虽然异源表达紫杉醇的产量很低，远不能满足生产要求，但是用于异源表达的宿主大肠杆菌与酿酒酵母大规模工业发酵生产条件发展成熟，在实际工业生产中将比植物内生菌更易操作控制，因此不应因为其现阶段产量不理想而放弃相关研究。产紫杉醇菌种诱变改良后，为获得更高产量菌株，可采用基因改组技术（gene shuffling）对诱变的正向突变株的原生质体进行融合、重组，进行进一步的菌种优化改良30。2005年，Zhao等31利用随机扩增多态性 DNA标记法（random amplifiedpolymorphic DNA，RA

22、PD）对诱变而得的两株紫杉醇高产株及其相应的母本进行分析，结果发现诱变株与其母本之间的紫杉醇合成相关基因的差异十分明显。由此可见，利用基因改组技术对紫杉醇产生菌进行提高产量的优化改良是切实可行的。5 结语利用微生物生产紫杉醇具有如下优点：生长速率较高，生产周期短；培养基构成简单，培养条件容易达到，易于降低成本；规模化发酵生产技术比较成熟。但是从目前研究水平来看，紫杉醇微生物发酵的产量仍然远低于商业化生产的要求。因此，筛选高产菌株与提高紫杉醇发酵产率的工作今后仍要进行一段相当长的时间，具体有以下几方面的工作：分离筛选新的紫杉醇产生菌；紫杉醇产生菌的遗传和生理代谢特点的摸索；针对微生物合成紫杉醇的

23、代谢途径的研究，为进行紫杉醇合成的代谢调控提供必要前提，尤其可提高紫杉醇产量的前体物、诱导物及支路代谢抑制剂的筛选；关键酶基因的克隆表达及紫杉醇产生菌的遗传转化系统的确立，为构建高产基因工程菌株打下基础。由于产紫杉醇的微生物菌株多为植物内生菌，大多数在发酵培养过程中生长状况不理想，因此，构建高产工程菌株是实现紫杉醇的微生物发酵法生产的关键。除文中所述的原生质体诱变、基因改组两种方法外，构建成熟的针对某紫杉醇产生菌的遗传转化系统，进行基于紫杉醇代谢途径的定向遗传改造的方法，也应得到相关研究人员足够的重视。Zhao32对树状多节孢的不同诱变株进一步进行融合与基因改组，将紫杉醇的产量在原有基础上又提

24、高了 48%左右。4.3 异源表达在其它微生物宿主体内进行紫杉醇的全合成也是一条将微生物发酵生产紫杉醇的工业化的途径。目前已应用于该研究中的微生物宿主有大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（ Saccharomycescerevisiae）两种。早在 1996年，Wildung等33将太平洋红豆杉的紫杉醇合成相关基因在大肠杆菌中进行表达，检验证实，所表达的蛋白具有催化 GGPP生成紫杉二烯的活性。经搜索比对，该蛋白的氨基酸序列与植物中萜类化合物代谢相关酶类具有较高的相似性。两年后，Hefner等34将加拿大红豆杉中的 GGPP合成相关酶类基因在酵母中进行表达，也获得了成功。与

25、 Hefner同时，Huang等35将 TS的cDNA序列在大肠杆菌中进行异源表达，所得的重组酶经纯化检测，发现其与植物中表达的 TS酶类结构相似度很高，且具有相同的体外催化活性。这396化工进展2012年第 31卷formation of the taxol side chainJ. J. Am. Chem. Soc.，1993，115（2）：805-807参 考 文 献20Stierle A，Stierle D，Strobel G A. The search for taxol producingmicroorganisms among the endophytic fungi of th

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