条件性基因敲除与敲入

1、条件性基因敲除与敲入,在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除观察整体推测功能”的研究思想仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后观察实验动物出现的各种变化，从而推

2、测疾病与基因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。,实现基因敲除的方法有多种，但基本上都是采用同源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)水平进行操作。胚胎干细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系，在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖，在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分子水平的基因操

3、作，之后再使这种已经发生了基因改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可以在整个生物体内实现预期的基因改变。,经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下：选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后与相应的载体进行重组，成为靶载体。分离试验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通过

4、筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。,通过上述方法所获得的基因敲除小鼠模型，其身体的各种组织、器官以及小鼠生存的各个时期都携带有突变基因，相应基因的功能也发生了变化。这是一种非常经典的基因敲除方法，该方法对阐明某些基因的功能做出了十分重要的贡献。但是，对于某些特殊的基因，该方法往往显得无能为力，这些基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内具有至关重要的功能。当这些基因突变后，胚胎往往不能发育至正常分娩，或者即使能够出生也会因为过于严重的生理缺陷而过早夭亡，无法开展后续研究，或者这些基因突变后影响到实验动物的繁殖功能而不能产生后代，进而不能获得携带突变基因的纯合子动物模型。针对上述问题，近年来出

5、现了一种特殊的基因敲除或敲入方法，被称为条件性基因敲除或敲入(conditional gene knock out or knock in)。这种方法是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特定阶段敲除某一特定基因的实验技术。其优势在于克服了经典基因敲除手段所遇到的上述问题，对于在特定的组织细胞和(或)特定的时间研究特定基因的功能，以及更好地建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。,一、条件性基因敲除的策略Cre/loxP重组系统,1Cre/loxP系统的原理,Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于 Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号

6、X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个loxP位点（序列）之间的特异性重组，使loxP位点间的基因序列被删除或重组。,loxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了loxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：,Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个lo

7、xP位点间的序列；2、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个loxP位点间的序列倒位；3、如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。,2Cre/loxP系统优点,Cre/loxP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的： Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子； loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成； Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可

8、以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。,3Cre/loxP系统的工作流程,利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，需要两只转基因小鼠。 第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细胞

9、被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到相应基因的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。,第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。 最后，让这两只小鼠进行交配，产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因。 很明显，在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子。只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达

10、，使其在生物体特定的部位、特定的条件下产生，就可以实现相应条件下某一特定基因的敲除。,迄今为止，研究者们已经成功地利用多个不同的启动子实现了在不同条件下的基因敲除，这些启动子可以是细胞类型特异的，如lck启动子(胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶状体)、钙调素依赖性激酶启动子(海马和大脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管)和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等。启动子也可以受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用，如干扰素反应Mxl启动子、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子和

11、四环素调节系统等。,loxP转基因动物的构建,loxP转基因动物是在基因组中待修饰基因区域的两侧各插入了1个loxP位点的转基因动物。该转基因动物的构建首先需要一种特殊的载体，这种载体主要由3个部分组成： 分别存在于打靶载体5 和3臂端，是与靶基因一定区域相同的同源序列，其作用是介导打靶载体与靶基因之间的同源重组。 位于5和3臂端之间有待敲除的靶基因区段序列或有待敲入的外源序列和选择标志基因。选择标志基因一般为neotk基因，含有两个选择标志：一个为G418抗性基因(neo)，为细胞提供针对G418的抗性，为正筛选标记；另一个为胸腺嘧啶激酶基因(tk)，可以把培养基中的更昔洛韦(gancicl

12、ovir)磷酸化为对细胞有毒的化合物，为细胞提供负筛选标记。 3个loxP位点，分别位于待敲除靶基因同源序列的两侧和选择标志基因的两侧。 一般采用线性化的打靶载体来转染胚胎干细胞，常选用位于同源序列边缘或之外的限制性内切酶作用位点作为打靶载体线性化的切点。取代型打靶载体整合进基因组的结果是靶载体中的序列置换掉基因组中的同源序列。,loxP转基因动物的构建一般采用胚胎干细胞基因转移法。在这个过程中，首先要构建具有3个loxP位点的打靶载体。该载体中loxP位点的分布情况如下：选择标志基因(如neotk)的两侧各一个，从而能够使选择标志基因在Cre的介导下消失，以避免它们在基因组中的存在可能给转基

13、因动物造成危害；预期要进行敲除的基因两侧各一个，在Cre的作用下可以介导目标基因的敲除。在载体构建成功后，用电穿孔等方法将其导入到胚胎干细胞中，使其以同源重组的方式整合进干细胞的基因组，之后经G418筛选，用PCR和DNA印迹(Southern blotting)等方法来确定靶基因是否发生了同源重组。最后，为了去除筛选标志基因，要向上述的胚胎干细胞中导人Cre的瞬时表达质粒。这时，在Cre的作用下，具有3个loxP位点的靶基因区域会产生3种后果：,发生型缺失，3个loxP之间的所有基因(靶基因和选择标志基因)全部被切除，只保留1个loxP位点。 发生型缺失，只有选择标志基因被切除，两个loxP

14、位点及其之间的靶基因被保留。发生了或型缺失的胚胎干细胞在更昔洛韦选择培养下均能生长，再用PCR和DNA印迹等方法来对缺失突变的结果进行鉴定。 型缺失，靶基因被切除而选择标志基因被保留，发生此型突变的细胞在更昔洛韦存在时无法生存。 经过更昔洛韦培养基筛选后，可以筛选出发生型缺失的胚胎干细胞。再用囊胚注射法将经过这种遗传改造的胚胎干细胞注入囊胚，最后移植入代孕母鼠的子宫内，获得具有型缺失突变的转基因动物，在其基因组中特定的基因位置具有两个loxP位点。,受精卵雄性原核显微注射法构建Cre转基因动物,Cre转基因动物即时空特异性表达重组酶Cre的转基因动物。构建此动物的目的在于为loxP转基因动物提

15、供重组酶Cre。由于在该转基因动物中Cre的表达被置于特异性启动子的调控之下，因此它会以组织细胞特异性和发育阶段特异性的方式向loxP转基因动物提供Cre重组酶，以便在特定的发育阶段、特定的组织细胞中使两个loxP之间的区域缺失。当然，实现此目标的最后方法就是让这两种转基因动物进行杂交。 构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相似，最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。,先将Cre时空特异表达载体线性化后注入雄性原核，使其以随机插入的方式整合进基因组，然后将该受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的输卵管或子宫内。受精卵雄性原核显微注射法的具体步骤简述如下

16、： 1准备假孕母鼠 将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 2受精卵的准备 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素(HCG)，以促使其超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 3基因导入 用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内。 4胚胎移植 将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟。 5对幼鼠的鉴定 (1)幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合。 (2)建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50

17、概率带有整合的基因供实验用。也可将合适的组织进行细胞培养，建立细胞系。 (3)自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，以鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)或放射免疫测定(RIA)等。亦可取胚胎进行分析。,受精卵雄性原核显微注射法构建Cre转基因动物,胚胎干细胞的囊胚注射法构建Cre转基因动物,先将Cre时空特异表达载体线性化，之后用电穿孔等方法将其导入胚胎干细胞中，并以同源重组的方式整合进胚胎干细胞的基因组。这种经过遗传改造的胚胎干细胞再被注入囊胚，最后将胚胎植入假孕母鼠的子宫，使

18、其发育成为一个个体。囊胚注射法的具体步骤如下： (1)选择合适的载体，将Cre重组酶的编码基因与其重组，构建重组质粒。 (2)重组质粒线性化后，用电穿孔、脂质体等方法将其转入体外培养的小鼠胚胎干细胞中。 (3)体外筛选稳定整合外源基因的胚胎干细胞。 (4)筛选出的胚胎干细胞被重新注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育为一个完整的胚胎。 (5)产出的嵌合体小鼠通过杂交，最终获得稳定整合Cre重组酶的纯合体转基因小鼠。,采用雄性原核显微注射法时，Cre表达基因是随机的整合到基因组中去的，因此其表达的时空特异性和表达水平除了受启动子的影响外，还会受到整合位点的影响，因此需要同时生产

19、多个转基因鼠家系，以便从中选出符合要求的转基因鼠。采用这种方法时选择合适的启动子就显得尤为重要。该方法的优点是操作过程比较省时省力。 另外一种构建Cre转基因小鼠的方法是采用同源重组，使Cre基因置于内源性启动子的控制之下。这个策略可以实现Cre基因表达的最佳化，因为这时所有的基因表达调控元件均处于天然位置，可以避免常规转基因小鼠通常出现的异位表达问题。此外，采用这种方法只要获得靶基因的同源序列就可以进行，没有必要再去详细研究其启动子。但是该方法的缺点是操作过程费时费力。因此，当有合适的启动子可供选择时，多数研究者宁愿使用雄性原核显微注射法生产Cre转基因小鼠。,由此我们知道，Cre转基因动物

20、的关键在于控制Cre基因表达启动子的选择，因为启动子活性的时空特异性决定了Cre基因表达的时空特异性，进而决定Cre介导的loxP转基因动物基因组中相应靶基因发生预期突变的时空特异性。可以理解，借助于Cre/loxP系统的作用，利用一种Cre转基因动物就可分别对多种基因在个体发育或疾病发生中的作用机制进行研究。理论上，Cre/loxP系统介导的条件性基因敲除具有对任何发育阶段的任何组织细胞中的任何基因进行功能研究的潜力。,条件性基因敲除的实现,在构建好上述两个转基因小鼠后，条件性基因敲除就比较容易实现了。所需要进行的最后一步操作就是让这两种转基因小鼠进行交配。所产生的子代小鼠同时具有Cre的外

21、源表达基因和经过loxP修饰的目的基因，根据Cre表达的时空特异性就可以实现目的基因在特定组织中、特定发育阶段发生预期的改变。,基于Cre/loxP系统建立的四环素诱导条件性基因敲除系统,该系统包含两个互补系统，分别为tTA依赖和rtTA依赖的基因敲除系统，现在又被称为TetOff(tTA依赖)系统和TetOn(rtTA依赖)系统。在这两个系统中，四环素控制转录因子tTA或rtTA与启动子Ptet的结合，从而调节下游基因的表达。所不同的是tTA与启动子Ptet的结合是不需要四环素的，四环素阻碍两者之间的相互作用；而rtTA与启动子Ptet的相互结合只有在四环素或者其衍生物多西环素(强力霉素)存

22、在的情况下才会发生，没有四环素或者多西环素时两者不发生相互作用。因此这两个系统以相反的方式对四环素进行反应，成为两个互补系统。,该系统含有3个基本的要素：tTA或rtTA，Ptet，四环素或多西环素。其中tTA或rtTA作为一种转录因子是一个融合蛋白，具有两部分：一部分为来源于原核生物体内的四环素阻碍蛋白(Tet repressor，Tet R)；另一部分为来源于真核生物体内，是真核细胞内转录因子的转录激活结构域，应用最为广泛的是单纯疱疹病毒编码的VPl6的酸性结构域。这两部分构成的融合蛋白(tTA或rtTA)可以受四环素或者其衍生物的调节而发生构象变化，从而改变与相应的DNA序列(四环素抗性

23、元件，Tet resistance operon，TetO)的结合能力。tTA或rtTA的另一个功能就是转录激活功能，当其在真核细胞内与相应的DNA反应元件结合后可以启动下游基因的转录。rtTA与tTA相比有几个氨基酸位置的突变，突变的结果是两者对四环素反应后产生的效应完全相反。rtTA只有在四环素存在的情况下才能与反应元件TetO相结合，而tTA只有在四环素不存在的情况下才能与TetO结合。在具体的应用中，tTA或rtTA被置于特定启动子的调控之下，以实现其在特定的组织器官中进行表达。,Ptet是一个受tTA或rtTA调控的启动子，含有一个RNA聚合酶启动子的最小功能单位和若干个TetO序列

24、，该启动子只有与tTA或rtTA结合时才能激活下游基因的表达。因此，在应用过程中Ptet被用来调控Cre重组酶的产生。 四环素或多西环素作为TetOn和TetOff系统的效应剂，与tTA或rtTA相互作用从而调节它们与Ptet的亲和力。多西环素是四环素的衍生物，由于其具有毒性小、所用剂量小等优点，在实际应用中更为广泛。该系统发挥作用的机制如图所示。,采用该系统进行条件性基因敲除时，要将受特异性启动子调控的tTA的表达载体转入小鼠体内，同时还要将受Ptet启动子调控的Cre重组酶的表达载体也转入小鼠体内。这样一个转基因小鼠与loxP的转基因小鼠进行交配，产生的子代小鼠中会在特定组织和器官中表达t

25、TA，tTA再与Ptet结合后激活下游的Cre重组酶的表达，实现特定基因在特定组织器官中的敲除。如果在子代小鼠出生时就给予四环素，并且一直维持下去，特定基因的敲除就不会发生，只有在停止四环素的应用后才会发生该基因在特定部位的丢失。采用rtTA系统与上述情况正好相反，在不用四环素时基因敲除不发生，只有给予四环素时才会导致特定基因在特定部位的敲除。因此，该系统可以对靶位点的剔除或修饰进行时间和空间二维调控。,基于Cre/loxP系统建立的他莫昔芬诱导条件性基因敲除系统,该系统将雌激素受体 (estrogen receptor，ER)的配体结合区(ligandbinding domain，LBD)和

26、Cre重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。为了消除内源性雌激素的影响，研究者将雌激素配体结合区进行了关键氨基酸的突变，从而使其不能与体内的生理性雌激素结合，而只能与外源性的雌激素类似物他莫昔芬结合，这样就消除了内源性雌激素所造成的非特异性基因敲除。该系统与四环素诱导系统相似，也可以对靶基因的敲除进行时间和空间二维调控。利用该系统，Schwenk等在1998年成功建立了B淋巴细胞特异启动子调控的E1SV40CreERT转基因小鼠，并成功实现了他莫昔芬的诱导，结果显示在B淋巴细胞中Cre介导的重组效率达到了80。,二、条件性基因敲除的策略Flp/FRT系统,该系统与Cre/loxP系统相同，也是由一个重组酶和一段特殊的DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp/FRT系统是