蛋白质检测方法

1、蛋白质的检测（参考GB/T6432-94）一、原理凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氮溢出，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。二、试剂（1） 硫酸 化学纯，含量为98%，无氮；（2） 混合催化剂 0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀；（3） 氢氧化钠 化学纯，40%水溶液（m/V）；（4） 硼酸 化学纯，2%水溶液（m/V）；（5） 混合指示剂 甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月；（6） 盐酸标准

2、溶液 基准无水碳酸钠法标定；a) 0.1mol/l盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。b) 0.02mol/l盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。（7） 蔗糖 分析纯；（8） 硫酸铵 分析纯，干燥；（9） 硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。三、仪器设备（1） 实验室用样品粉碎机或研钵；（2） 分样筛 孔径0.45mm（40目）；（3） 分析天平 感重0.0001g；（4） 消煮炉或电炉；（5） 滴定管 酸式，10、25

3、mL；（6） 凯氏烧瓶 250mL；（7） 凯氏蒸馏装置 常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；（8） 锥形瓶 150、250mL；（9） 容量瓶 100mL；（10） 消煮管 250mL；（11） 定氮仪 以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。四、分析步骤（一） 仲裁法1. 试样的消煮 称取试样0.5-1g（含氮量5-80mg）（精确至0.0002g），放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强活力（360-410）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，消化全过程至少2h。

4、2. 氨的蒸馏（1） 常量蒸馏法 将试样消煮液冷却，加入60-100mL蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地向凯式烧瓶中加入50mL氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯式烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1-2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。（2） 半微量蒸馏法 将试样消煮液冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示

5、剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补充硫酸。准确移取试样分解液10-20mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。注：两种蒸馏法测定结果相近，可任选一种。（3） 蒸馏步骤的检验 精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，选仲裁法或推荐法“氨的蒸馏”中的步骤进行操作，测得硫酸铵含量为21.19%0.2%

6、，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。（二） 推荐法1. 试样的消煮 称取0.5-1g试样（含氮量5-80mg）（精确至0.0002g），加入消化管中，加2片消化片（仪器自备）或6.4g混合催化剂，与420下在消煮炉上消化1h。取出冷却后加入30mL蒸馏水。2. 氨的蒸馏 采用全自动定氮仪时，按仪器本身常量程序进行测定。采用半自动定氮仪时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL硼酸为吸收液，加入2滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50mL氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100mL为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液

7、均流入锥形瓶内。3. 滴定 用0.1mol/L的盐酸标准溶液滴定吸收液，溶液由蓝色变成红色为终点。五、空白测定称取蔗糖0.5g，代替试样，进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸溶液的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液体积不得超过0.3mL。六、分析结果的计算和表述计算见下式：粗蛋白质=V2-V1c0.01406.25mVV100%式中：V2滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL； V1滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL； c盐酸标准溶液浓度，mol/L； m试样质量，g V试样分解液总体积，mL V试样分解液蒸馏用体积，mL；0.0140与1.00mL盐酸标准液【c（HCL

8、）=1.000mol/L】相当的、以克表示的氮的质量。 6.25氮换算成蛋白质的平均系数。七、 重复性 当粗蛋白质含量在25%以上时，允许相对偏差为1%。当粗蛋白质含量在10%-25%以上时，允许相对偏差为2%。当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。浙江紫香糖业使用的定氮仪是上海新嘉型号：KDN-AZ智能型定氮仪蒸馏器 KDN-AZ智能型定氮仪是我公司根据用户对仪器自动化的需求进行改进的一款半自动凯氏测定装置，在A型的基础上安装了自动蒸馏控制元件，使原本繁琐的蒸馏控制更为简便，提升了工作效率，保证了样品测定的精准性，并且加装了自动排水系统，用户不用担心因蒸发炉水未排尽而造成下次开机出现烧保险丝的烦恼。测定范围：0.1-200mg氮（0.05%95%）