7-6重大疾病模型研发及其专门化品系

1、十二五”国家科技计划项目答辩,实验用小型猪重大疾病模型研发及其专门化品系培育,项目申报单位：中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所 报 告 人 ：李奎,项目参加单位： 南方医科大学 中国医学科学院北京协和医院 中国人民解放军第三军医大学 深圳华大基因研究院 中国农业大学 吉林大学,提纲,一、任务需求分析 二、项目目标 三、研究内容 四、技术路线 五、技术难点 六、考核指标 七、创新性 八、科研条件,一、任务需求分析,1.小型猪是理想的疾病动物模型 啮齿类动物模型和人类之间存在诸多差异 与小鼠等相比，小型猪在形态学、解剖学、生理学、内分泌学、基因组学等方面与人类具有很高的相似性 小型猪作为糖尿病、心

2、血管疾病、鼻咽癌等模型具有明显的优势 世界各国加大了转基因猪疾病模型的研究力度,一、任务需求分析,2.建立小型猪人类重大疾病模型应用前景广阔 代谢性疾病和癌症等非传染性疾病已成为危害人类健康的“头号杀手” 建立动物疾病模型是研究疾病发生机理、药物动力学、新药安全及疗效评价等的关键 缺乏小型猪2型糖尿病、动脉粥样硬化、小型猪乳腺癌和鼻咽癌模型,一、任务需求分析,3.重大疾病模型表型评价 国际上，多个机构已开展了大规模疾病模型的表型评价，这些机构已制定了小鼠表型评价的标准操作规程 小型猪疾病模型表型评价也已积累了大量的基础数据 建立小型猪重大疾病模型表性评价的标准操作规程、数据库和共享平台十分必要

3、,一、任务需求分析,4.专门化品系培育具有重大市场需求 小型猪重大疾病模型专门化品系：指基于相关疾病自发性易感个体或转基因模型动物，经遗传和表型共同选育，繁育三代以上形成的健康状况良好、生长发育正常、繁殖能力稳定，特定阶段发生或可诱导发生某种人类疾病典型临床特征的群体，群体内有效个体数不少于30头 专门化品系能保证疾病动物模型的标准化和规范化,一、任务需求分析,4.专门化品系培育具有重大市场需求 国际上已形成SinclairTM 、YucatanTM、HanfordTM等小型猪疾病模型品系 我国还没有小型猪疾病模型品系 我国拥有独特而又丰富的小型猪种质资源 ,五指山小型猪近交系、巴马小型猪封闭

4、群等均历经二十多年的选育,为重大疾病模型专门化品系培育奠定了重要基础,二、项目目标,1.以本组2008年开始高脂、高糖和高胆固醇诱导小型猪2型糖尿病和动脉粥样硬化两个模型群体为基础，获得疾病易感个体，经系统选育，培育自发性模型品系 2.通过完善基因修饰技术，建立多基因时空特异性诱导五指山近交系等小型猪2型糖尿病、动脉粥样硬化、乳腺癌和鼻咽癌疾病发生的模型，经系统选育建立专门化品系 3.建立小型猪2型糖尿病、动脉粥样硬化、乳腺癌和鼻咽癌等模型表型分析标准和技术规范，以及多层面比较分析数据库；对转基因疾病模型、自发性模型及专门化品系进行系统评价,三、研究内容,课题1：转基因小型猪代谢性疾病模型制备

5、 完善多基因时空特异性表达调控方法 制备小型猪细胞功能调控模型：通过对IAPP、GLUT2等基因的诱导表达或敲除 制备小型猪胰岛素抵抗糖尿病模型：通过脂肪、肌肉等组织特异性敲除胰岛素促葡糖利用相关基因 制备小型猪2型糖尿病多基因协同模型 制备小型猪动脉粥样硬化模型,三、研究内容,课题2：转基因小型猪肿瘤模型制备 制备过表达人p53突变体和EB病毒LMP1基因细胞系，并获得鼻咽癌疾病模型 制备组织特异性敲除p53基因小型猪 制备同时组织特异性敲除p53基因和组织特异性表达LMP1基因的转基因小型猪 制备多基因共表达的转基因乳腺癌模型 制备同时组织特异性敲除p53和ERCA1基因的基因修饰猪,三、

6、研究内容,课题3：转基因代谢性疾病和肿瘤模型表性评价 开展2型糖尿病模型相应指标的标准化检测技术体系研究 开展动脉粥样硬化模型血脂指标、血管影像学和病理学的标准化分析技术体系研究 开展肿瘤模型肿瘤发生、转移指标和肿瘤发生早期标志分子等的检测和分析技术研究 开展转基因和自发模型表型评价研究 建立小型猪生理生化学、解剖学等数据库 建立疾病模型制备用技术资料库,三、研究内容,课题4：代谢性疾病和肿瘤等模型专门化品系培育 确定影响疾病发生发展过程和病理组织学变化的基因 对我国主要实验用小型猪进行大规模全基因组扫描和表性评价 培育具有自主知识产权的五指山小型猪2型糖尿病和动脉粥样硬化专门化品系2个以上

7、培育具有2型糖尿病、动脉粥样硬化、乳腺癌、鼻咽癌等专门化品系3个以上,四、技术路线,五、技术难点,1.国际上小型猪自发性模型专门化品系稀少 美国“Low K”和”“High K”品系由于缺乏标记基因选择及大动物近交发生衰退，分别只维持了5个世代和4个世代 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、第三军医大学、中国农业大学已培育出优秀的小型猪近交系和封闭群，并结合大规模分子标记进行系统选育，在小型猪实验动物化培育及管理方面均积累了丰富经验,五、技术难点,2.小型猪转基因疾病模型制备技术难度较大 已建立的技术： 锌指核酸酶和转座子技术 大片段基因转移技术 组织特异性Cre-loxp系统 多肽2A位点和复

8、合基因转移技术 Tet-on/Tet-off技术 国际上转基因小鼠疾病模型制备已相当成熟,五、技术难点,3.小型猪重大疾病模型评价平台缺少成熟的经验可借鉴 已获得大量各种组织器官组织学切片 在疾病模型及表型评价方面积累了丰富经验，并建立了相关领域的疾病检测和评价平台 通过收集、整理相关资料，集成标准化规范化的重大疾病模型评价平台,六、考核指标,1.获得诱导模型重要候选功能基因筛选标记10-15个；获得2型糖尿病和动脉粥样硬化疾病易感个体；建立自发性2型糖尿病和动脉粥样硬化专门化品系2个以上 2.建立小型猪细胞凋亡和胰岛素分泌紊乱2型糖尿病模型5-8个；胰岛素抵抗引发2型糖尿病模型8-10个；猪

9、细胞功能调控和胰岛素抵抗多基因协同2型糖尿病模型6-8个,六、考核指标,3.建立小型猪基因敲除或RNA干扰动脉粥样硬化模型5-8个 4.建立小型猪乳腺癌模型3-5个；建立小型猪鼻咽癌模型3-5个 5.建立转基因小型猪疾病模型专门化品系3个以上,六、考核指标,6.建立小型猪代谢性疾病和肿瘤等模型评价指标的检测技术标准和规范 7.建立疾病模型相关基因信息及生理生化等数据库；完成30个以上小型猪转基因模型及5个以上转基因和自发模型专门化品系的表型评价 8.获得原创性成果2项以上，建立相关技术规范和标准草案5项以上,六、考核指标,9.建立小型猪疾病模型研发与评价平台2个；申请或获得专利30项以上 10

10、.发表科研论文60篇以上，其中IF5.0的10篇以上 11.建立一支小型猪疾病模型研究和专门化品系培育的技术队伍,七、创新性,1.在国际率先规模化的制备一批五指山小型猪多基因调控模型 2.首次建立稳定的2型糖尿病和动脉粥样硬化自发性模型及其专门化品系 3.在国际上首次制备三阴性乳腺癌模型 4.在国际上率先建立相关疾病特征数据库及小型猪疾病模型评价技术平台,八、科研条件,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 中国实验用小型猪种质资源中心 科技部规划实验动物领域八大种质资源中心之一 拥有剖腹净化、仔猪隔离器饲养、遗传质量控制室、环境质量监控室、生物学特性研究和实验用小型猪信息管理系统等功能设施 具有年

11、生产SPF猪200头，清洁猪300头和普通级实验用猪1500头的能力,中心概貌,SPF 猪舍,污水处理池,值班室,仔猪饲养间,空调机组,发电机,SPF区猪舍,清洁区,八、科研条件,提出的实验动物国家标准,八、科研条件,体重变化,平均值T检测,个体进展程度,八、科研条件,腹脂,内脏脂肪,试验组眼肌,对照组眼肌,试验组胰腺脂肪,实验组背膘,试验组四头肌,试验组心脏,八、科研条件,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 目前正在进行五指山近交系等小型猪2型糖尿病及动脉粥样硬化易感个体筛选、转基因制备疾病模型等研究 建立了糖尿病血液生理生化检测、糖耐量分析、胰岛素抗性评价、细胞因子评价等表型和评价体系 建立

12、了动脉粥样硬化动物模型，制订小型猪动脉粥样硬化的血液学、血管照影等评价技术 通过显微注射制备了转GH12猪、生长激素基因猪诱导载体(Tet-on)猪及条件表达TRE-GH猪,南方医科大学肿瘤研究所 所长姚开泰教授，博士生导师，中国科学院院士 重大疾病的转录组与蛋白质组学教育部重点实验室 构建了可视化的鼻咽癌转移治疗动物模型，开展了基于基因芯片、miRNA芯片、甲基化芯片、蛋白细胞增殖型等研究，均为新型鼻咽癌转基因动物模型的建立及后续表型分析打下坚实的基础。 基础设施，相关研究工作进展，成果（待补充,八、科研条件,八、科研条件,中国医学科学院北京协和医院 设有国内领先的中心实验室、临床药理中心、实验动物和卫生部内分泌重点实验室 设有糖尿病、肥胖症等8个研究中心或课题组 拥有抗体制备及激素检测平台和内分泌与代谢疾病基因检测平台 基础设施，相关研究工作进展，成果（待补充,中国人民解放军第三军医大学 国家重点学科、心血管药品临床试验基地 建立了国家小型猪医学生物学应用技术平台 建立了医用