DNA甲基化检测方法

1、DNA甲基化检测方法,DNA甲基化检测方法总览,主要检测途径,基于重亚硫酸盐转化的方法(金标准) 不基于重亚硫酸盐转化的方法,基于重亚硫酸盐转化的方法,质谱分析 水解核苷酸 质谱分析,基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理1,基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理2,应用一: 直接测序法（Direct sequencing,用于甲基化分析的样本常常是混合样本，不适合直接直接进行sanger测序分析,直接测序法,图6 PMVK基因扩增产物反向测序结果,图7 TRIB3基因扩增产物正向测序结果,应用二： 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequence PCR，BSP,注： A：癌组织

2、；B：癌旁组织；：未甲基化；：甲基化,43A,43B,369bp,43B,BSP克隆测序结果,BSP克隆测序甲基化率三维图形,优点:能准确的检测出每个DNA分子单倍体型的 甲基化状态，同时能分析不同CpG位点之间 的甲基化状态的联系。 缺点：需要对PCR产物克隆，操作繁琐，费时费 力，克隆子的数目影响结果的准确性。 测序重复性差,应用三： 甲基化特异性PCR (methylafion-specific PCR，MS-PCR,U M U M U M ladder,100,150,200,250,MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化,图 MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片,甲

3、基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化,MSP扩增产物凝胶电泳图,研究结果,注：M表示 甲基化，U表示未甲基化 B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5为正常对照组五例标本； H2O为阴性对照；m为50bpMarker,SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态,甲基化特异性PCR,优点： 操作简便；敏感性高；Nested-MSP提高灵敏度，便于分析微量检材 缺点： 引物设计要求高； 只能作定性研究； 存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性； 只能了解部分位点的甲基化状态,MethyLight,对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而 实现甲基化的定量分析,优点：

4、增加了重亚硫酸盐转化和DNA复性的质控对照 避免了电泳、酶切等操作 缺点：PCR bias,应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,基于限制性内切酶的工具酶,甲基化特异性的限制性内切酶(MDRE)： 可以识别甲基化的胞嘧啶,甲基化敏感性的限制性内切酶(MSRE)： 可以识别甲基化的胞嘧啶,基于限制性内切酶的甲基化分析方法,MSRE-PCR原理,图 1-1 MSRE-PCR原理图 注：左图DNA无甲基化, DNA被切断, 无法得到PCR产物; 右图DNA有甲基化, DNA保

5、持完整,可以获得PCR产物,应用举例二,采用甲基化敏感性限制性内切酶技术结合PCR的方法（MSRE-PCR）筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化差异的基因,注：M：Marker；E：加酶体系；A：癌组织；B：癌旁组织；空：水空白,酶识别位点内含有一个及以上CpG位点,应用条件,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,优点： 方法相对简单； 可进行甲基化水平的定量研究； 需要样本量少,缺点： 由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序列的CG将被忽略； 只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义； 存在酶消化不完全引起的假阳性的问题,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法,应用五： Re

6、striction Digestion and Real-Time PCR(qAMP,基本步骤,举例：The evalution of differentially methylated region(MDR) of imprinted gene U2af1-rs1,in testis and liver of mouse,Primer are designed to flank Notl(N),Hhal(Hh),and McrBc(M) Restriction sites in the DMR region,Liver and testis genomic DNA templates are

7、 PCR amplicated following digestion with no enzyme(sham),Notl,Hhal(Hh) or McrBc.Amplication using a second primer pair that has been designed to a sequence devoid Of restriction sites demonstrates that the templates are of equal concentration,The difference in the Ct value of an enzyme-digested temp

8、late relative to the sham-digested template determinates the levels of DNA methylation in each tissue,MSRE,MDRE,应用六：基于亲和纯化的甲基化分析方法,基于亲和纯化的甲基化分析方法,应用七：ChIP-Seq技术,ChIP-Seq,应用八：芯片技术在甲基化检测中的应用,启动子区甲基化芯片技术,基因芯片杂交信号图,应用九、 质谱技术（Mass Spectromeric Analysis of Cytosine Methylation by Base-Specific Cleavage an

9、d Primer Extension Methods,如图所示切下的每个片段含有一个或两个CpG位点，在质谱图上甲基化片段和未甲基化片段大小相差16Da或32Da,Base-Specific Cleavage,Primer Extension Methods,如图所示，用ddC和ddT终止延伸后，在质谱图上显示出甲基化组（ddC）和未甲基化组(ddT)的质谱峰,二者相差16Da,Base-Specific Cleavage 检测的是一个酶切后片段的甲基化状态，用于在长片段DNA序列（如基因启动子区域）中筛选甲基化位点并确定每个甲基化位点的甲基化程度，而在基因的甲基化谱确定后可以用Primer

10、Extension Methods精确的对每个CpG位点的甲基化程度进行定量检测， Primer Extension Methods最多可以实现25个位点同时检测,质谱法检测的优势,灵敏度准确性高。 操作较简便。 局限性： DNA样本要求纯度较高，提取过程中的小离子，未消化完全的蛋白，RNA对结果有干扰作用。 需用质谱仪,应用十、 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法（methylation-sensitive singlenucleotide primer extension (Ms-SNuPE),扩增,基因组DNA样本,重亚硫酸盐 转化,ExoSAP消化,PCR,引物延伸,加入SNP引物和 SN

11、aPshot Mix,SNP引物延伸 (加入ddT或ddC,SAP处理,分析,310/3100样本准备 加入GS120LIZ内标,ABI310/3100电泳 选用E5和POP4胶,数据分析 （GeneScan,样本分型 （Genotyper或GeneMapper ID,步骤,1,2,3,4,5,6,这是一个多重SNaPshot的检测结果，总共检测了6个CpG位点，阴影峰 代表甲基化的C，空白峰代表未甲基化C。位点1、2和4显示大约50%的甲 基化率，而位点3、5和6显示0的甲基化率,应用十一：高分辨熔解曲线分析 MS-HRM,HRM技术： 用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点 鉴定感兴趣的

12、CpG 岛,HRM技术原理,HRM技术原理,HRM特点,高灵敏性：可检测低达0.1%甲基化程度。 高通量：1次可同时检测不超过384样本，适用于大样本多位点甲基化扫描。 高重复性：重复性100%。 使用范围广：不受碱基位点局限。 操作简便：只需设计特异引物，无须序列特异性探针，无需测序。 标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测,缺点：检测序列长度不应超过100bp； 只能进行半定量检测,应用十二：焦磷酸测序法,焦磷酸测序法（Pyrosequencing,焦磷酸测序法（Pyrosequencing,焦磷酸测序,焦磷

13、酸测序,焦磷酸测序,焦磷酸测序的优势： 灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域。 除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化。 对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点； 对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本,应用十三：Quantification of Methylated DNA by HeavyMethyl Duplex PCR,Principle of HeavyMethyl (A) When the DNA is methylated, the blocker oligonucleotides (soli

14、d black) do not bind, leaving the primer binding site accessible for the primers (gray arrows) to bind and amplify the target. The amplication is detected with a methylation specific oligonucleotide probe solid black, labeled with fuorescent dye (F) and quencher (Q) in a 5-exonuclease assay, used he

15、re as an example for a real-time detection method. (B) When the DNA is unmethylated, the blocker oligonucleotides bind, blocking the access of the primers to their binding sites. No PCR product is generated,sample throughput versus genome coverage. A plot of sample throughput against genome coverage

16、 for various DNA methylation techniques. Throughput is determined by the number of samples that can be analysed per experiment, based on large eukaryotic genomes. Coverage is determined by the number of CpGs in the genome that can be analysed per experiment,不同甲基化检测方法的检测通量,1.筛选Differentially methylated region,课题流程,2.对筛选出的DMR进行测序，验证是否具有甲基化差异性，同时筛选出随龄 变化相关性强的CpG位点,3.检测每个样本CpG位点的甲基化率，做回归分析,做回归分析需要的样本量很大，每个样本需要检测多个CpG位点。基于