液相色谱溶剂系统与优化-天施康内部培训

1、液相色谱溶剂系统的选择和优化液相色谱溶剂系统的选择和优化 液相色谱法中的高些液相色谱和薄层色谱，溶剂系统常是分 离的成败的关键！因此溶剂系统选择及优化非常重要。 本次学习的重点：如何根据样品的性质与分析要求，按照分 子间作用力的关系，正确的选择溶剂并组成溶剂系统进行优化， 选出最佳溶剂系统，获得事半功倍的效果。 参考书参考书液相色谱溶剂系统的选择与优化液相色谱溶剂系统的选择与优化 （孙毓庆）（孙毓庆） ，已上，已上 传到群共享。传到群共享。 第一小节：第一小节：液相色谱基本概念 第二小节：第二小节：液相色谱溶剂系统 第三小节：第三小节：溶剂的基本性质及其对色谱的影响 第四小节：第四小节：薄层色

2、谱法及溶剂系统 第五小节：第五小节：高效液相色谱法及溶剂系统 第六小节：第六小节：梯度洗脱，工作中遇到的实例和讨论 黄文统 QQ403318043 2013-03-29 第一小节第一小节 液相色谱基本概念液相色谱基本概念 一、液相色谱的概念和分类（一、液相色谱的概念和分类（2012 年秋学习内容）年秋学习内容） 利用组分在固定相和流动相间的分配系数差异，而分离、分析的 方法称为色谱法（或称层析法） ，是一种物理或物理化学的分离方法。 以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法（liquid chromatography ,LC） 。 分离原理：差速迁移 色谱分类：吸附色谱、分配色谱、化学键合相色谱、

3、空间排阻色谱、 离子交换色谱、亲和色谱，等等（请简述原理或应用举例） 。 色谱法 液相色谱法液相色谱法 气相色谱法 超临界流体色谱法 柱色谱法 平板色谱法 逆流分配色谱法，微电动分析法 薄层色谱法 高效液相色谱法 经典液相柱色谱法 填充柱色谱 毛细管柱色谱法 纸色谱法 二、基本概念和基本理论二、基本概念和基本理论 1、相平衡参数、相平衡参数 分配系数：物质在两相中达到分配平衡后，样品组分在固定相中 的浓度与在流动相中的浓度之比。 容量因子：达到分配平衡后，组分在固定相中的质量与在流动相 中的质量之比。 2、保留参数、保留参数 保留时间，保留体积，比移值 3、柱效参数、柱效参数 区域参数正态分布

4、曲线中的标准偏差（） ，半峰宽和峰宽 组分流出色谱柱过程物质的分散程度。 理论塔板数与理论塔板高度（塔板理论） 4、分离参数、分离参数 分离度：R=1.5 可以实现完全分离（99.7%） 。 分离数（SN，又叫峰容量）：相邻峰的分离度 R=1.177（98.1% 分离）时，可容纳的峰（斑点）数量。SN 越大，分离效果越佳。 5、分离方程、分离方程 2 2 1 1 4k kn R a b c 其中，n 为色谱柱的理论塔板数； 为相对保留值或分配系数比 （K2/K1） ；k2为相邻两组分中保留时间长的组分的容量因子。 a 项取决于柱效，柱效高（n 大） ，a 项大。b 与 c 项相关联，而 且都与

5、色谱柱及流动相的性质有关，但 b 主要取决于流动相的种类 （极性） ，在流动相的种类） （包括元数）选定后，调整流动相的配 比，可改变洗脱能力，进而改变 c 项。 选择实验条件，首要任务是使选择实验条件，首要任务是使 11，即，即 b0b0。只有在。只有在 11 的的 前提下，增加柱效前提下，增加柱效 n n，适当增加，适当增加 k k2 2，才能增加分离度，才能增加分离度 R。 6、速率理论及范第姆特方程（略）、速率理论及范第姆特方程（略） 7、超高压液相色谱（、超高压液相色谱（UPLC）：）：采用 1.7m 粒径的填料，内径 1.0cm 及 2.1cm，柱长 510cm，柱效为一般高效液相

6、色谱柱的 3 倍 以上。参见 2010 版中国药典一部丹参滴丸项下的指纹图谱。 第二小节第二小节 液相色谱溶剂系统液相色谱溶剂系统 正确选择溶剂组成溶剂系统及合适的配比，需要熟悉各色谱法的 分离机制和溶剂的分类。 一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱 流动相为液体，固定相是固体吸附剂的色谱法，称为液-固吸附色 谱。 常用吸附剂硅胶、氧化铝。如工作中最常用到的硅胶（薄层） 色谱、氧化铝柱等。 注意：少数以硅胶薄层色谱方法并非吸附色谱！请举例 1、分离机制：分离机制：被分离的组分（溶质分子）与流动相争夺吸附剂表 面的活性中心，靠溶质分子吸的吸附系数的差别而分离。 mR VKStt/1 0 其中，S

7、是色谱柱中吸附剂的表面积；Vm是流动相在色谱柱中 占有的体积；K 是吸附平衡常数。因为容量因子 k=KS/Vm,所以 kttR1 0 在吸附色谱法中，选择实验条件务使组分间的容量因子在吸附色谱法中，选择实验条件务使组分间的容量因子 k 产生产生 差别，以达到分离的目的。差别，以达到分离的目的。 请问：硅胶吸附色谱表面的活性中心是什么？ 2、固定相（硅胶）与溶质的亲和力、固定相（硅胶）与溶质的亲和力 硅胶与溶质分子的亲和力顺序亲和力顺序（容量因子顺序）：饱和烃芳烃饱和烃芳烃 有机卤化物硫醚醚硝基化合物酯有机卤化物硫醚醚硝基化合物酯醛醛酮酮醇醇胺砜胺砜 亚砜酰胺羧酸亚砜酰胺羧酸。与硅胶亲和力大的溶

8、质，容量因子 k 大，保 留时间长，晚出柱（薄层色谱中 Rf 值小） 。 3、流动相的洗脱能力、流动相的洗脱能力 液-固色谱法流动相的洗脱能力与溶剂强度参数和介电常数等有 关，选择性主要取决于溶剂的分子间的类型（溶剂分类的组别） 。 常用 Snyder 溶剂强度参数（单位吸附剂表面的吸附能）来定 量地描述流动相的洗脱能力。定义式如下： AE / 式中，E 为吸附能；A 为吸附剂的表面积。溶剂强度参数值 是溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能。值越大，固定相 对溶剂的吸附能力越强，即溶剂的洗脱能力越强，则溶质的 k 值越 小。 溶剂溶剂溶剂强度溶剂强度溶剂溶剂溶剂强度溶剂强度 己烷0.00乙酸

9、乙酯0.38 异辛烷0.01二噁烷0.49 四氯化碳0.11乙腈0.50 四氯丙烷0.22异丙醇0.63 氯仿0.26甲醇0.73 二氯甲烷0.32水20.73 四氢呋喃0.35乙酸20.73 乙醚0.38 上表列出了以硅胶为吸附剂时的一些纯溶剂的值。当某溶质 在某硅胶柱（或硅胶薄层板）上进行分离时，如果选用的初始溶剂 太强使得样品组分的 k 值过小，那么就要从表中选择值较小的溶 剂来代替；反之，如果初选溶剂的值太小而使样品组分的 k 值过 大，则应选用较大的溶剂。这样，通过尝试就可以找到强度合适 的溶剂为流动相。 二元流动相：二元流动相：两种纯溶剂适当配比浓度可以产生适当的洗脱强 度（以容量

10、因子 1k10，k=35 为最佳） ；寻找等洗脱强度不同 溶剂组成的二元溶剂系统，以提高选择性提高选择性，因组成不同，分配系数 比 不同，选择性不同。 4、流动相的选择性、流动相的选择性 选择性（分配系数比选择性（分配系数比 ）不仅决定于，而且还受诸如试样分 子与溶剂分子间的氢键作用等二次效应的影响。预测 值随着溶剂 成分变化时的经验规律 强溶剂很大或者很小时都会得到最大的 值； 含醇含醇的溶剂系统常常会得到与其他溶剂系统不同的 值，因为 样品和溶剂间的氢键氢键作用会使 有很大的变化！ 含有强碱性或非碱性强溶剂组分的溶剂系统可得到最大的 值。 二、液二、液-液分配正相色谱和正相键合相色谱液分配

11、正相色谱和正相键合相色谱 主要用于分离极性、中等极性和弱极性分子。 1、液、液-液分配正相色谱色谱：液分配正相色谱色谱：采用含少量水（含水量 17%）的失活 硅胶做固定相。流动相选择规律与吸附色谱完全（？）一致。 2、正相键合相色谱：、正相键合相色谱：如氰基键合相、氨基键合相。 选择分离条件时，务使样品的各组分在固定相与流动相中的溶解 度产生差别，即使 K 或 k 产生差别，才能分离。 mR VKStt/1 0 正相色谱法溶剂系统的洗脱能力用溶剂的极性参数（P）值表示。 溶剂溶剂P组别组别溶剂溶剂P组别组别 正己烷0.01 氯仿4.1 异丙醚2.4 乙酸乙酯4.4 乙醚2.8 甲醇5.1 二氯

12、甲烷3.1 丙酮5.1 正丙醇4.0 乙腈5.8 四氢呋喃4.0 乙酸6.0 水10.2 P值大，极性大，洗脱能力大。值大，极性大，洗脱能力大。 多元溶剂系统：洗脱能力也用极性参数 P表示（极性参数具有加 和性） ；选择性选择性则由构成流动相的各纯溶剂的性质（类别类别）左右。 Snyder 溶剂分类：根据溶质与溶剂分子间作用力不同将常用溶剂 分为 8 组。与组溶剂为质子受体溶剂；组溶剂为偶极作用力 溶剂；为质子给予体溶剂，其他组的溶剂的性质介于其间，作用 力类型不典型。不同组别的溶剂虽然洗脱能力可能相同，但选择性 不同。例如甲醇和丙酮的 P都是 5.1，极性相同，但组别不同，选择 性不同。用甲

13、醇分别不开的物质对，改用丙酮后，有可能分开，反 之亦然。 三、反相（键合相）色谱法的分离机制与流动相三、反相（键合相）色谱法的分离机制与流动相 1、分离机制：、分离机制：疏溶剂理论。 2、流动相、流动相 反相色谱法的流动相的极性大于固定相，通常是用甲醇、乙腈或 四氢呋喃等极性溶剂与底剂水组成二元或多元流动相。 溶剂强度因数（溶剂强度因数（S）：）：流动相的洗脱能力用溶剂强度因数（S） 衡量。 溶剂溶剂S 值值组别组别溶剂溶剂S 值值组别组别 水0 二噁烷3.5 甲醇3.0 乙醇3.6 乙腈3.2 异丙醇 4.2 丙酮5.1 四氢呋喃4.5 多元流动相的强度因数 Sab值计算公式： bbaaab

14、 SSS 式中，Sa与 Sb分别为纯溶剂 a 与 b 的溶剂强度因数；a和 b 分别为纯溶剂 a 与 b 的体积分数。该公式可以计算多元溶剂系统的 强度因数，而且可以计算等洗脱强度的替代溶剂组成。 3、反相流动相的选择、反相流动相的选择 （1）二元流动相：）二元流动相：一般以洗脱力最弱的水（组）做为基础溶 剂（底剂） ，再加入一定量的可与水互溶的有机极性调节剂构成，常 用的首选极性调节剂为甲醇（组）与乙腈（组） 。按洗脱能力的 要求（重点组分的 k=25） 。组成最常用的甲醇-水或乙腈-水洗脱剂。 （2）多元流动相组成：）多元流动相组成：若二元流动相不能满足需要，可配置多 元流动相。多元流动相

15、的构成参考原则： 在二元流动相中加入少量的四氢呋喃（组） ，常能改善某些 难分离的物质对的分离度； 若某些色谱峰拖尾，可加减尾剂。一般常用的减尾剂为有机碱 类，如三乙胺等。其减尾的作用，主要是有机碱与硅胶的酸性硅羟 基作用，降低了硅羟基的吸附作用。 用水、甲醇、乙腈、四氢呋喃，按四面体法组成三元或四元溶 剂系统，并进行优化，选出最佳溶剂系统。 分离弱有机酸或弱有机碱，可用离子抑制色谱法。 示例：确定等洗脱剂的替代溶剂系统示例：确定等洗脱剂的替代溶剂系统 用 OSD 柱分离苯、萘、联苯、蒽及芘等芳烃类混合物，可用甲醇 -水（80:20）为流动相，分离效果较好。欲改为等洗脱能力的乙腈- 水为流动相

16、，请问该溶剂系统的配比应是多少？ 甲醇-水（80:20）的 S=3.00.80+0.00.20=2.4 等洗脱能力的乙腈-水的 S，也应该是2.4，因此，2.4=3.4 乙 腈。则 乙腈=0.718，得等洗脱能力的替代溶剂系统为乙腈-水 （71.8:28.2） 。 离子抑制色谱法：在反相色谱法中，通过调节流动相的 pH，抑 制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机 弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法（ion suppression chromatography, ISC） 。 需要注意的是，色谱柱有需要注意的是，色谱柱有 pH 适用范围。适用范围。pH8可能使载体硅

17、胶可能使载体硅胶 溶解；溶解；pH2可能使键合相的键合基团脱落。可能使键合相的键合基团脱落。 第三小节：第三小节：溶剂的基本性质及其对色谱的影响 1、紫外截止波长、紫外截止波长 高效液相色谱仪应用最多的检测器是紫外检测器，用于检测有紫 外吸收的样品（具有 - 或 p- 共轭结构的化合物） 。使用紫外 检测器的时应考虑截止波长。 紫外截止波长的定义：“到达检测器时的透射光强被削弱到 10% 的入射光强（以空气为参照，吸光度 A=1）时，对应的波长就称为 紫外截止波长” 。 溶溶 剂剂截止波长范围截止波长范围/nm 乙腈190 水190 正己烷、环己烷190205 脂肪醇（甲醇、异丙醇）20522

18、0 脂肪醚（二乙醚等）210220 氯代烷烃（二氯甲烷、氯仿）220270 乙酸酯（乙酸乙酯）225245 苯、烷基取代苯（甲苯、二甲苯）270290 脂肪酮（丙酮）320340 四氢呋喃 2、黏度黏度 溶剂的黏度对色谱分析的影响，表现为溶剂在色谱系统中对被压 缩产生的抵抗力。 22 1000P p d LF 其中，P 是溶剂对柱长 L 柱上的压力差， 是柱内半径，F 是 流动相的流速 dp是粒度直径， 是流动相的黏度。 压力差正比于溶剂的黏度、柱长和流速，反比于粒度直径的平方。压力差正比于溶剂的黏度、柱长和流速，反比于粒度直径的平方。 高黏度溶剂的使用会引起填料的迅速损坏，明显降低色谱柱的寿

19、 命，增大色谱系统的维持费用。 3、混溶性和溶解度混溶性和溶解度 混溶性混溶性：两种化合物如果能以任意比例相混而不出现两个不相溶 的相； 溶解性：溶解性：一种化合物以一定量在另一种溶剂中能溶解，在一定量 溶剂 B 中，能溶解最大量的溶质 A 就称为 A 在 B 中的溶解度。 例如，二氯甲烷和水是互不相溶的，因此它们具有不相混溶性， 但是水中可以溶解 1.6%的二氯甲烷，而二氯甲烷中能够溶解 0.2% 的水。 溶解性受温度影响很大。因此当使用的溶剂组成接近溶解饱和度 时，就必须关注其是否可能会发生沉淀。 另外，溶解时会显著放热（例如醇与水混合）或者吸热（例如乙溶解时会显著放热（例如醇与水混合）或

20、者吸热（例如乙 腈与醇混合）腈与醇混合） ，混合后的体积会缩小或者增大，混合后的体积会缩小或者增大。 4、缓冲剂及其他添加剂：缓冲剂及其他添加剂：用量及浓度（结晶析出的问题） 5、挥发性：挥发性：流动相脱气时应注意。 6、不同溶剂的注意事项不同溶剂的注意事项 水：纯化水的要求； 醚：四氢呋喃等，容易形成过氧化物； 醇类和酮类：截止波长高 含氯烷烃：氯仿、二氯甲烷等，见光降解，通常此试剂中加稳定 剂； 7、样品溶液样品溶液 溶解样品的溶剂应采用流动相，可避免系统峰的干扰。 溶剂峰和溶剂效应溶剂峰和溶剂效应 第四小节：薄层色谱法及溶剂系统第四小节：薄层色谱法及溶剂系统 一、薄层色谱法的基本理论和概

21、念一、薄层色谱法的基本理论和概念 1、基本概念和理论、基本概念和理论 比移值（Rf） 分离度与分离数 塔板数与斑点宽度 斑点压缩效应 展开方式（上行、下行、直线、圆形等等） ； 洗脱规律：洗脱规律：一般认为吸附色谱的原理是竞争吸附。样品的极性越大， 越容易被吸附因而 Rf 越小；而流动相的极性越大，洗脱能力越强因 而 Rf 越大。 小常识：展开距离的平方与所需时间成正比，展开距离加倍则消耗4倍时间。 2、直线展开中、直线展开中 Rf 值与值与 k 值（容量因子）的对应关系值（容量因子）的对应关系 上表数值显示，k 值小于 4 的物质，占有薄层板 80%的空间；而 k 值大于 4 的物质，仅占据

22、薄层板的 20%的空间。由此可知，薄层 色谱适于分离 k 值小于 4（或 Rf大于 0.2）的物质而不适合分离 k 值大的物质。k 值小于 4 的有被薄层分离开的可能，而 k 值大的物 质因为展开空间不够，被薄层分开的可能性很小。 二、气固平衡和液固平衡二、气固平衡和液固平衡 1、气固平衡、气固平衡 气固平衡是平面色谱的特殊情况，对平面色谱过程有很大影响。 k00.5123456789 Rf10.670.500.330.250.200.170.140.120.110.10 例证： 用乙酸乙酯分别在甲板（未经饱和的薄层板）和乙板（事先用乙 酸乙酯饱和15min）上展开苏丹-，结果在甲板上的苏丹-

23、其 Rf 等于1而乙板上的苏丹-其 Rf 仅为0.65。 此例说明：由于预饱和，使本来应该出现在流动相前沿的样品出 现在 Rf=0.65，说明真正的前沿（由毛细作用进入薄层板的流动相 所抵达的位置）的确在 Rf=0.65 位置，而前面的流动相是预先吸附 在薄层板上（肉眼当时看不出来）而被后来进入薄层板的流动相 “挤”到了前面才显出了肉眼可察觉的状态。多元混合流动相的气 固平衡比较复杂，固定相既优先吸附极性大的气体（蒸汽压往往偏 低）的倾向；又有优先吸附蒸汽压大的气体（极性往往偏低）的倾 向，故不好预测。 2、液固平衡、液固平衡 液固平衡的影像主要表现在多元混合流动相上。固定相优先吸附 极性大的

24、溶剂，会导致流动相组成的改变，而流动相组成的改变有 可能使本来互溶的流动相在板上分层，形成多个前沿。当然，流动 相组成的改变也使展开过程包含有梯度展开过程，这往往有对分离 有利。 另一方面，板上液相组成的改变也会反过来影响气液平衡，从而 又影响气固平衡；大气中的水分也会被薄层板吸附，这既要影响薄 层板的性质，也会影响到气液和固液平衡；所有这些都难用数学语 言精确描述，但又对薄层色谱过程有重大影响！ 三、薄层色谱的操作技术三、薄层色谱的操作技术 1、活化、活化 活化与否根据具体情况决定。 北方气候干燥，自然阴干与活化后的薄层板差异不大，一般可不 活化；但如对重现性有较高要求，希望将所有条件严格固

25、定，可考 虑活化。 活化后的薄层板在空气中暴露 3min（相对湿度 50%情况下） ， 会丧失原有活性的一半；暴露 15min，吸附的水分已达最大值。因 此最关键也是最困难的步骤是如何控制环境的湿度。此外，点样等 操作时间也要尽可能短或严格控制。否则，活化就失去了意义。 2、饱和、饱和 是否需要饱和，存在争议。 饱和的主要目的是消除边缘效应边缘效应。 饱和的好处是：Rf 值的重现性较好； 饱和的缺点是：分离效果可能略逊于不饱和室，因为不饱和室的 有效展开距离较长；其次是挥发可能导致薄层板上的流动相组成有 微妙的变化，产生类似梯度展开的效果。 另：实际操作中我们常常讲的“饱和 XX 分钟”分两个

26、层面： a.将展开剂倒入层析缸中，密闭。此时，展开剂挥发，展开剂蒸 汽在展开室内到达饱和，此饱和可称之为“室饱和室饱和” 。如果未达到 “室饱和”即开始展开，则展开过程中薄层板上的展开剂挥发到展 开室中，将会影响薄层板上的溶剂组成； b.将薄层板放入置有展开剂的层析缸中，但未浸入展开剂中。此 时，展开室内的蒸汽被薄层板吸附，当蒸汽分子在薄层板上“吸附- 解吸附”达到平衡时，此时饱和可称之为“板饱和板饱和” 。 室饱和和板饱和的过程可以同时进行。 另外由此可见，展开剂用量不能过小展开剂用量不能过小。 3、点样量、点样量 点样的斑点宽度：在薄层板不超载的情况下，实际点样宽度是多 少，最终斑点宽度就

27、增加多少；斑点宽度受点样宽度的影像，但影 像不大。 点样量：点样量越少越好。但实际过程中，应根据鉴定限决定点 样量。点样量过小无法观察到，点样量过大则会过载。条带状点样 的方式，可以适当提高点样量同时保证点样量不过载。 四、薄层色谱法的流动相四、薄层色谱法的流动相 在薄层色谱法中，固定相选择的余地很小，流动相的种类很多， 分离的好坏主要由流动相决定。因此，掌握流动相的分类和选择性 原则很重要。 1、溶剂的分类、溶剂的分类 可用于薄层色谱法的溶剂有几十种，合理的分类有，利于选择。 （1）Snyder 分组分组 Snyder 选择乙醇（质子给予体） 、二氧六环（质子接受体） 、硝 基甲烷（偶极分子

28、）作参考物质，测定了 81 种常用溶剂与这三种物 质的相对亲和力，分别用 Xe、Xd、Xn表示（Xe+Xd+Xn=1） 。以 Xe、Xd、Xn为顶点在三角形坐标图上将 81 种溶剂分成 8 组。 组别溶剂类型代表性溶剂 脂肪醚异丙醚、甲基叔丁基醚 脂肪醇甲醇、乙醇 吡啶及其衍生物，酰胺，亚砜四氢呋喃 二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺乙酸、二甲基甲酰胺 二氯甲烷、二氯乙烷二氯甲烷 脂肪酮、酯、砜、腈乙腈、丙酮、二氧六环 芳烃、卤代芳烃、硝基化合物芳醚笨、甲苯、硝基甲烷 氟代醇、间甲酚、水、氯仿水 组溶剂 Xe 值较大，属于质子受体溶剂，以脂肪醚为代表； 组 Xd 相对较大，属于质子给予体溶剂，以氯仿为代

29、表；组 Xn 相 对最大，属于偶极作用力溶剂，以二氯甲烷为代表；组溶剂为脂 肪醇类，按分类为质子受体溶剂，以甲醇为代表。 请问：同样是卤代甲烷，为什么氯仿是质子给予体溶剂，而二氯 甲烷却是偶极作用力溶剂？ 诱导力诱导力 色散力色散力 取向力取向力 （2）模糊聚类溶剂分组）模糊聚类溶剂分组 张敬宝在 Snyder 实验数据基础上改进了分组。 组别溶 剂说 明 1 乙腈、硝基乙烷电子接受体 氯苯、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯电子给予体 2 甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇质子给予体 3 冰醋酸、水、甲酸、氯仿强质子给予体 4 乙醚、三乙胺质子接受体 5 二氯甲烷、二氯乙烷大偶极矩 6 环己烷、正己烷、

30、四氯化碳 2、流动相选择的原则和方法流动相选择的原则和方法 （1）预实验：）预实验：微量圆环法、小型色谱法 （2）选择原则）选择原则 通常选择二元以上的流动相系统，便于调节极性。混合展开剂 中，比例较大的主要溶剂起到溶解物质和基本分离的作用，通常极 性较低。极性较大的溶剂用于调节 Rf 值，中等极性的溶剂往往起到 助溶作用，或降低流动相的黏度。初试的目的是使斑点群初试的目的是使斑点群 落在薄层落在薄层 色谱适宜的展开区间（色谱适宜的展开区间（Rf0.2） 。在此基础上再考虑相邻斑点的分 离问题。 一般认为：改变流动相中的溶剂比例，主要改变被测物质的 k 值，从而改变被测物质的 Rf 值；而改变

31、流动相中的溶剂种类，主要 改变分配系数的比值，有可能改变相邻物质的分离度。问题是：一 旦改变流动相的种类，又会重新面临使斑点群落在薄层色谱适宜展 开区间的问题。这是一个不断尝试和调整的过程。 当需要更换流动相中的溶剂时，不要再在同一类种选择，而应 该在其他溶剂中选择。因为同一种类的流动相，其作用力基本相同， 更换后产生明显效果的可能性不大。而不同种类的流动相，其作用 力不相同，更换后有可能造成差异，改善分离。 如果斑点有比较长的拖尾，有可能使弱酸、弱碱或其盐类的解 离造成的（也可能是样品量太大） 。因解离的部分机型强滞后，未解 离大部分前移后因化学平衡原理继续解离，周而复始，会造成极宽 的条带

32、状斑点。加入一些酸、碱可起到抑制作用。对于强极性流动 相仍不能对推动的斑点，可考虑换碱性氧化铝固定相。 薄层色谱的特点是塔板数少，因此，各种溶剂优化方法所能挖 掘的潜力也有限，如果方法比较复杂，就不如按上述原则粗试合算； 由于同一原因，指望在一块薄层板上用一套溶剂系统分离开复杂混 合物也不现实，改换分离方式，往往是明智的选择。 第五小节：高效液相色谱法及溶剂系统第五小节：高效液相色谱法及溶剂系统 本节重点以高效液相色谱法为例，讲述用于溶剂系统组成选择的 三角形法三角形法。 1、溶剂的洗脱参数溶剂的洗脱参数 溶剂对溶质洗脱能力的评价方法。第二节已经介绍了溶剂强度参 数（基于色谱的吸附平衡） ，溶

33、剂的极性参数（P） （基于色谱的 分配平衡） ，溶剂强度因数（S） （用于反相洗脱） 。洗脱参数具有加 和性。 bbaaab SSS 2、确定适宜的洗脱强度确定适宜的洗脱强度 通过调节混合溶剂的配比可连续改变溶剂的洗脱强度，从而改变 样品组分的容量因子。例如，欲确定分离某混合物的适宜洗脱强度， 可以采用乙腈-水二元溶剂系统进行贯序优化试验确定溶剂的组成， 先用 100%乙腈，然后加水调整乙腈-水的比例，逐步降低溶剂强度。 试验结果见下图。可见，采用乙腈-水（40：:60）时分离效果及容 量因子均好，此时的洗脱强度因数计算为 S=0.43.2+0.60=1.28 确定适宜的洗脱强度还可以通过梯度

34、洗脱完成。 预分离的某未知混合组分可分三种情况：能够明确组分的种类 和数量；只明确含有某种或几种组分，其他组分数量和种类不明 确；组分的数量和种类均不明确。 例 1：对于某未知混合组分的分离，初始试验采用一弱的溶剂系统， 如乙腈-甲醇-水（10:10:80） ，随后使用仪器梯度功能快速线性的把 溶剂组成调整成可能的强度最大的流动相，比如乙腈-甲醇-水 （40:40:20） 。注意初始溶剂系统应比第一组分出峰所需的溶剂系统 弱，而结束的溶剂系统应比最后出的峰所需的溶剂系统更强，以保 证有合理的选择结果。本例中，第一峰对应的有机溶剂 45%，故可 尝试采用乙腈-甲醇-水（22.5:22.5：55）

35、为流动相。 (a)流动相：乙腈-甲醇-水（10:10:80，保持 3min）箭头乙腈-甲醇-水（40:40:20，梯 度 7min，后保持 5min） (b)流动相：乙腈-甲醇-水（22.5:22.5：55） 注意：梯度滞留时间约 2 分钟 梯度系统滞留时间的测定方法梯度系统滞留时间的测定方法 例 2：取代苯胺混合物等度洗脱条件设计。先进行一个 60min 梯度 试验，以 5%100%乙腈-水梯度，谱图如下，标出初峰和末峰的保 留时间（tRa和 tRb） ，设tR=tRa-tRb，则比值tR/tG可用于判断等度洗 脱的条件，tG为梯度时间，即 60min。若要求 0.5k20，则tR/tG 应

36、小于 0.40。 本例中，tR/tG=（24.5-9.5）/60=0.250.40，可采用等度洗脱。 Snyder 等将以上用一次梯度试验寻找等度洗脱合适流动相组成 的方法改进发展成为应用表格寻优的洗脱方法。见下表 1 和表 2。 表表 1 1 等度分离可行性的确定等度分离可行性的确定 允许的 tRz/min tRa/min 1k100.5k20 1.5 2817 31221 41424 51626 71929 102333 152938 203544 254049 304554 355059 405564 40 不确定度 3min5min 表表 2 2 根据梯度洗脱结果估计等度洗脱流动相组成

37、根据梯度洗脱结果估计等度洗脱流动相组成 （乙腈浓度）估计值 tRz/min k=5k=10k=15 560 1019125 15292214 20373022 25453830 30534638 35615446 40696254 45777062 50857870 55938678 601009486 6510094 不确定度 3min5min 3、 容量因子与有机改良剂分数容量因子与有机改良剂分数 x 的关系的关系 在反相高效液相色谱法中，容量因子 k 的对数是有机改良剂分数 x 的线性函数。 ）（101ln 10 kxbbk 或者 ）（10ln 2 210 kxbxbbk 其中，b 为常

38、数。X 为有机改良剂分数（x 与 关联） 。 应用： 在实验中，可以通过两次实验可以建立二元一次方程组，求得 被分离各组分的 b0和 b1，由此可以预知 x 与 k 的对应关系； 由 x 和 k 的对应关系，可计算出能使各组分达到分离要求的 x，即有机改良剂的分数（如乙腈-水系统中，乙腈的体积分数） 。 关于该函数的应用，请参考“人参皂苷的反相高效液相色谱多台人参皂苷的反相高效液相色谱多台 阶梯度优化方法阶梯度优化方法” （高等学校化学学报 ，马小琼等） 。 4 4、用于溶剂系统组成选择的三角形优化法用于溶剂系统组成选择的三角形优化法 在 Snyder 溶剂选择三角形的基础上，诸多三角形法被用

39、于溶剂 系统（流动相）组成的选择。 反相高效液相色谱普遍采用的一种方法如图 7-8 所示。每个三角 形的顶点都设计成一个单独的流动相组成。这里先选择 3 种选择性 差别较大的纯溶剂。这些点分别表示 100%甲醇、乙腈和水。其中任 何两种组分连线上的点表示两种组分的混合物。被标上 1、2、3 的 三个点分别代表 50:50 的甲醇与水、水与乙腈、甲醇与乙腈的混合 物。在三角形内部的所有点都是这三种流动相所构成的混合物。标 号 4 的点代表比例为甲醇-乙腈-水（1:1:1）构成的流动相。选择溶 剂的过程就是在三角形上寻找优化的流动相组成，使达到理想的分 离。可以应用能使各峰产生“最好”分离的三种流动相作为一个新 三角形的顶点。例如，在以上的例子中，如果点 4、2 和乙腈三点结 果是最可被接受的，则后面的实验就应设计点 5、6、7、8见图 7- 8（b）。反复成功的实验这个过程最终将得出最好的分离点，那么 这个分离就被优化了。 应用这样的三角形法的时候，同时利用等强度因数溶