微生物的分离与纯化

1、实验一、微生物的分离与纯化,实验目的,1、熟悉培养基制作原理； 2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤； 3、了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具体操作方法； 4、了解土壤微生物的分离纯化的基本原理； 5、学习并掌握微生物分离纯化技术方法,一、培养基的制备与灭菌,培养基是人工配制的微生物生活环境，其主要用途是繁殖及分离接种微生物，传代或保存微生物，鉴别微生物的类属，研究微生物的生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制剂等。其营养成分包括微生物生长所需要的水分、碳源、氮源、无机盐及某些生长因子（维生素、辅酶）等,二、实验原理,1、满足微生物生长培养所需的营养要素： 碳源、氮

2、源、无机盐、维生素、生长因子等 2、合适PH值 3、抑制其它微生物生长的物质,分类,主要用于增菌,用于检测动力及保存菌种,用于分离鉴定细菌,分类,三糖铁培养基,SS培养基,普通琼脂培养基,血液琼脂培养基,庖肉培养基,培养基的制备程序,1、调配 过滤 矫正pH（7.0-7.6） 分装过滤 灭菌（121.3，20-30分钟） 鉴定是否有菌 放入冰箱冷藏备用 2、因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所需的pH高 3、鉴定是否有菌可将培养基置于37 培养24小时，然后观察,干燥箱,细菌过滤器,用于滤过除菌的各式滤器,手提式灭菌锅,坐式灭菌锅,高压蒸汽灭菌器,卧式灭菌锅,三、实验器材,1

3、、试剂：牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、NaCl、PH试纸、琼脂、葡萄糖、孟加拉红、FeSO47H20、MgSO47H20、 KNO3、 K2PO33H20 2.仪器及其它 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠,四、实验方法和步骤,1、微生物常用玻璃仪器的包扎和棉塞的制作 培养皿的包装每10套一包，用旧报纸包扎 （或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。 吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。 玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。 三角瓶的包扎,1.牛

4、肉膏蛋白胨培养基的制备,1）计算 （2）称量 准确称取各种成分。 （3）溶解 向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍放冷。 （4）调pH值 用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用10NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 （5）分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图1-1） （6）包扎 试管扎成捆。 （7）灭菌 高压蒸汽灭菌1520min,1、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 3.0g、蛋白胨10g、 NaCl 5.0g、水1000ml、 PH7.4-

5、7.6 2、高氏1号培养基（放线菌） 可溶性淀粉 20g 、 NaCl 0.5g、琼脂 15-20g、FeSO47H20 0.01g、MgSO47H20 0.5g 、 KNO3 1g 、 K2PO43H20 0.5g、水 1000ml、 PH7.4-7.6 3、马丁氏培养基（真菌） KH2PO4 1g、 MgSO47H20 0.5g 、蛋白胨 5g、葡萄糖 10g、琼脂 15-20g、水 1000ml、 PH,2. 培养基的制备与分装,1）三角瓶固体培养基的制备 1.称量按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） 2. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 3.完全溶解

6、后，补充水分，调pH值（不要调过头） 4.分装置三角瓶中，注意装液量 5. 加棉塞，包扎，高压蒸汽灭菌,121,0.10Mpa,20min,2）试管斜面固体培养基的制备,a.称量按培养基配方比例依次准确地称取药品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） b. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 c.完全溶解后，补充水分，调pH值 d.在培养基未融化之前，用10mL移液管快速加入试管内，每根7-8mL，塞上棉塞，包扎，灭菌，灭菌完后摆斜面,3.培养基、无菌水、器皿的灭菌,1.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内，湿热灭菌。 2.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。 3.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌,二、

7、土壤微生物的分离、纯化,土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。 基本原理：是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量,实验步骤,1、采样一般定点于耕作层0-20cm，先除去表土1-2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。 2、制备土样稀释液 吹吸几次混匀 另留一管不稀释留作对照（CK,无菌操作,倾注法接种,先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每个平皿倾注约15 ml的牛肉膏蛋白胨培养基（48）待冷凝，混合均匀,分区划线法纯化,计数,要求30300之间计数。CK除外 每克湿土样细菌数量平均菌落数稀释倍数土壤样品水分系数1（1样品水分百分数）土壤样品细菌数量（个克干土）每克湿土样细菌数量样品水分系数,思考题,1.培养基配好后，为什么必须立即灭