微生物的实验室培养降解尿素和纤维素用

1、专题 微生物专题,微生物概念及分类,微生物培养,微生物分离和计数,微生物应用,一、微生物概念及分类 1、概念：是指自然界中那些形态微小、结构简单，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看清楚的生物,第1节 微生物的实验培养,生物分类,动物界： 植物界： 真菌界： 原生生物： 原核生物： 病毒,大型真菌、霉菌酵母菌,细菌、放线菌、支原体、蓝藻、衣原体,变形虫、草履虫,DNA型病毒、RNA型病毒,真核生物,原核生物,非细胞生物,细胞生物,小资料：乳酸菌每小时产生乳酸能达到自身重量的成千上万倍；大肠杆菌每小时分解的糖是自身重量的两千倍，每20分钟可分裂一次，如保持这一速度，则两天即可超过地球的重量,微生

2、物的代谢为什么如此旺盛呢,微生物表面积和体积的比很大，约是同等重量成年人的30万倍，使它们能迅速与外界环境进行物质交换,二、微生物培养,1）概念：按照微生物对营养物质的不同需要，配制出供其生长繁殖的营养基质,1、培养基,2）营养成分,碳源,氮源,温度、PH、渗透压、O2及特殊营养物质等,1、科学家们用脉胞霉（一种真菌）为材料，进行科学研究，用基本培养基来培养脉胞霉。基本培养基中所含的营养要素一般包括： _ 2、酵母菌可用于食品工业的废水处理，废水中的淀粉或废糖可与为酵母菌的生长提供_类营养物质。 3、用乳酸菌制酸奶，加入的蔗糖是作为_类营养物质加入到牛奶中的。 4、硝化细菌的碳源、氮源、能源依

3、次为_,碳源、氮源、水、无机盐,碳源,碳源,CO2、 NH3 、NH3氧化释放的化学能,微生物所需的营养要素,碳源,氮源,水,无机盐,无机碳源：CO2等自养型 有机碳源：葡萄糖等异养型,N2：固氮菌（根瘤菌等） NH3：硝化细菌 其他：铵盐、硝酸盐、尿素、蛋白胨,特殊营养物质（维生素、氨基酸和碱基等）、PH、温度、氧气等,3）培养基的种类,物理性质,加大量琼脂,加少量琼脂,不加琼脂,用于微生物的分离和计数,观察微生物的运动和鉴定菌种,用于工业生产,3）培养基的种类,化学成分,化学成分、含量已知,含有天然物质，化学成分、含量未知,用于微生物的分类和鉴定,用于工业生产,3）培养基的种类,用 途,基

4、本培养基+某种物质,基本培养基+指示剂或化学物质,抑制不需要；促进需要微 生物生长,发生特定颜色反应等，证明微生物的存在,分离菌种,鉴别菌种,青霉素选择出霉菌和酵母菌,伊红-美蓝遇大肠杆菌落呈深紫色带金属光泽,选择培养基,1）不加碳源的培养基 分离自养型微生物 2）不加氮源的培养基 分离固氮菌 3）加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌 4）加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌,练习：（10全国）某细菌固体培养基的组成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是，碳源是，氮源是。已知只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于培

5、养基。按照化学成分分类，该培养基属于培养基。从同化作用类型上看，用该培养基培养的细菌属于,葡萄糖,尿素,琼脂,选择,合成,异养型,思考：自然界中微生物是混杂的生活在一起的，如何分离出某种微生物（如纯化大肠杆菌）,2、实验操作大肠杆菌的纯化培养,1）制备培养基,计算,称量,溶化,调PH值,灭菌,倒平板,无菌技术,1、获取纯化培养物的关键是防止外来杂菌 的入侵,2、无菌措施,1)对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒；对将培养用的器皿、接种工具和培养基进行灭菌,2)实验操作时已灭菌材料等应避免与周围物品接触；实验操作应在酒精灯火焰附近进行；接种工具等应在酒精等火焰上灼烧后使用,1)概念：用温

6、和的物理方法和化学方法杀 死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子,消毒与灭菌,消毒,2)常用消毒方法,灭菌,1)概念：用强烈的物理方法和化学方法杀死物体表面或内部所有的微生物（包括芽孢和孢子,灼烧灭菌 干热灭菌：160-170 下加热1-2h。 高压蒸汽灭菌：100kPa、121 下维持15-30min,2)灭菌方法,无菌技术,1、获得纯净培养物的关键是？ 防止外来杂菌的入侵 2、消毒与灭菌的区别？ 消毒是杀死部分对人体有害的微生物；灭菌 是杀死所有微生物。 3、对培养基灭菌的方法是_，对接种针灭菌的方法是_，对玻璃器皿灭菌的方法是_，对实验操作者的手用酒精_处理，实验操作

7、结束需不需要灭菌？_,高压蒸汽灭菌法,灼烧灭菌,干热灭菌,消毒,需要,倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板,平板倒置原因：防止培养基冷却产生水滴滴落培养基上，造成污染,2、实验操作大肠杆菌的纯化培养,1）制备培养基,计算,称量,溶化,调PH值,灭菌,倒平板,原则：目的明确、营养协调、PH值适宜,2）纯化大肠杆菌,微生物接种方法,平板划线法 稀释涂布平板法,平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的细胞群体，即得到单一菌落,平板划线法,稀释涂布平板法： 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将

8、不同稀释梯度菌液分别涂布在固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，进而形成单个菌落,系列稀释操作,1,2,3,4,5,6,1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号,2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀,3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管,10-4,10-5,10-6,平板划线法,稀释涂布平板法,相同点：分散出单细菌形成单菌落来分离菌种,不同点：分别通过划线和稀释分散出单细菌，稀释涂布平板法除分离菌种外还可以对微生物计数,三、微生物的分离和计数,

9、思考：如何寻找和分离某种微生物,实例1,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找,多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。如果让你寻找这种耐高温的酶，你会去哪找,启示：分离菌种要人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长，即用选择培养基来分离菌种,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物，只有耐热菌被筛选出来,思考：为什么耐热菌能从热泉中被筛选出来,一）分离微生物原理：选择培养基分离,1、活菌计数法（通过统计菌落估算活菌数） 原理：在稀释度足够高时

10、，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数,二）微生物计数方法,注意事项 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。原因是_ _。 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。(细菌：稀释度104-106；放线菌：稀释度103-105；霉菌：稀释度102-104) 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数,当两个或多个细胞

11、连着一起时，平板上观察到的菌落只有一个,2、显微镜直接计数法,利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察,缺点,1、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,三）实例,课题背景,1）尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用,2）细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3）常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能

12、分解尿素,4）课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基,从物理性质看此培养基属于哪类,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源,碳源：葡萄糖 氮源：尿素,培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物,4) 培养基选择分解尿素的微生物的原理,实验的具体操作 .土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土

13、样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 .制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品的稀释,取样涂布,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验,实例2：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150

14、个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因,原因：土样不同 培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样(或加等量无菌水)的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题,设置对照,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度,纤维素分解菌的筛选（教材P28）

15、 选择_的环境，采集土样制成样品。将样品接种在以_为唯一碳源的选择培养基上培养，目的是增加纤维素分解菌的浓度。采用_法,将样品接种到含有刚果红的固体的培养基上，挑选产生_的菌落来筛选纤维素分解菌,纤维素丰富,纤维素,稀释涂布平板,透明圈,2、分解纤维素微生物的分离,实验操作,土壤取样,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（含刚果红,挑选产生透明圈的菌落,筛选并增大菌种浓度,稀释菌种,微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d

16、 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d,微生物的培养与观察,三.结果分析与评价 1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确,2、微生物分离原理,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长,用选择培养基,二）纯化大肠杆菌,1、将准备培养的菌种放到培养基中的过程叫做_。 2、微生物接种的最常用方法

17、是_和_ 3、能够获得单一菌落的接种方法有_和_ 4、能够测定样品中活菌数的接种方法是_,平板划线法,稀释涂布平板法,接种,平板划线法,稀释涂布平板法,稀释涂布平板法,生物,细胞生物,动物 植物 真菌 原生生物,非细胞生物,真核生物,原核生物,细菌 放线菌支原体衣原体蓝藻,病毒,微生物,酵母菌、 霉 菌、蘑菇,微生物的实验室培养一、基础知识（一）培养基,1、配制培养基的基本原则（确定培养基配 方的依据）_ 2、多数培养基都含有_等四类营养物质，少数微生物还需要加入特殊的营养物质即_. 3、最常用的碳源是_；蛋白胨或牛肉膏可以为细菌提供_类营养物质 4、微生物的培养条件主要包括 _,根据微生物的

18、营养需要配制,水、无机盐、碳源、氮源,生长因子,葡萄糖,氮源和碳源,温度、PH、渗透压、O2等,笔记,例题：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,1、该实验方案的目的是 _ 2、A是从小鼠的脾脏中取得 _,该细胞能够产生_ 3、取A细胞前，必须给小鼠 _ 4、图中B为_过程，常用_作为诱导剂,制备单克隆抗体,B细胞 抗体,注射抗原,细胞融合 灭活的病毒,例题：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,5、杂交瘤细胞继承_的 遗传特性，既能_,又能 _。 6、C过程指细胞培养，该过程包括_培养和_培养两个阶段。 7、单克隆抗体的特点是 _ 8、

19、将单克隆抗体与抗癌药物相结合，制成_,双亲细胞 无限增殖 分泌特异性抗体,原代 传代,特异性强、灵敏度高，并可大量制备,生物导弹,5、选择培养基（笔记,乳糖,5.0g,乳糖,5.0g,NH4Cl,4.6g,乳糖,5.0g,NH4Cl,4.6g,乳糖,5.0g,NH4Cl,4.6g,乳糖,5.0g,NH4Cl,4.6g,微生物的分离：科赫的平板划线法,自然界中的微生物都是混杂生活在一起的，给研究和应用带来了很大困难。19世纪后期，德国细菌学家科赫发明了固体培养基，尤其是用琼脂做凝固剂的固体培养基，成功解决这一问题，科赫将微生物样品稀释后，用针尖沾取少量稀释菌液在固体培养基上连续划线，由于微生物在

20、固体培养基上生长部位固定，不久就会在培养基表面长出多种菌落，科赫推断相同的菌落来自同一个种，于是挑选某一种菌落的微生物，经过几次相同的培养过程后，就得到了纯种。应用固体培养基，科赫分离出了炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、结核杆菌等。1905年科赫因结核杆菌的研究成果而获诺贝尔生理学奖,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见、具有一定形态结构子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据,摸底考试复习安排,阅读笔记 复习学案（重点是自己不会的、做错的习题） 作业 2011高考总复习-学生用书-生物P151161 要求：填写基础知识、例题、考点训练 2011高考总复习-学生卷-生物P

21、107112；P114116（去掉12、13、19、23、25、30,1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,称量 按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖,计算,溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至100mL,灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（35套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌,2、制备培养基的操作排序 溶化（使各种原料、琼脂等

22、加热溶化） 灭菌 调PH值 计算（各成分用量） 称量 倒平板(培养基冷却至50,倒入培养皿) 正确的操作顺序：_,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗,原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件,接种环,接种针,结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离,基因工程,基本工具 操作步骤 基本原理,细胞工程,植物细胞工程,动物细胞工程,植物