食品理化检验 维生素的测定

1、第十一章 食品中维生素的测定,Determination of Vitamin in Food,一、概述 二、脂溶性维生素的测定（重点、难点） 三、水溶性维生素的测定（重点、难点）,一、概述,（一）维生素的分类及共性 （二）常见维生素的生理功能 （三） 维生素的测定意义,（一）维生素的分类 目前已发现的维生素约有二、三十种，按溶解性可分为两大类： 脂溶性维生素：A、D、E、K等； 水溶性维生素：B、C等（如B1、B2、B6、B12和C等）,维生素都具有以下共同特点： 这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在； 它们不能供给机体热能；也不是构成组织的基本原料； 主要功用是通过作为辅酶的成份调节

2、代谢过程，需要量 极小； 它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取； 长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。,维生素A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜 炎、夜盲症等疾病。 维生素B1：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经 炎，帮助消化，促进发育。 维生素B2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。 维生素C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。 维生素D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的 代谢，并能防止软骨病。,（二）常见维生素的生理功能,（三）维生素的测定意义 评价食品的营养价值； 开发利用富含维生素的食品资源； 指

3、导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症； 研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导制定合理的生产工艺条件及贮存条件，最大限度地保留各种维生素； 监督维生素强化食品的强化剂量，防止维生素摄入过多引起中毒。,二、脂溶性维生素的测定 脂溶性维生素的理化性质 脂溶性维生素的测定方法,常与脂类物质共存于食物中，摄食时一道被人体吸收。 1.溶解性： 不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂； 2.耐酸碱性： 维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定； 维生素E对酸稳定，对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。,（一）脂溶性维生素的主要理化性质,3耐热性、耐氧化

4、性： 耐热性 氧化性 VA 好，能经受煮沸 易被氧化 （光、热促其氧化） V D 好，能经受煮沸 不易被氧化 V E 好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被氧化 （光、热、碱促其氧化）,根据上述性质，测定脂溶性维生素时，通常： 皂化样品 类脂物和维生素分开 有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物) 浓缩 溶于适当的溶剂 测定。 （食物中脂溶性维生素常与脂肪共存，一道被人体吸收，所以要除去脂肪，防止干扰。） 在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。 对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。,常用的测定方法有: 薄层色谱法、

5、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等。 高效液相色谱法：快速、高效、高灵敏度等优点， 是我国卫生标准分析方法,（二）脂溶性维生素的测定方法,食品中VA和VE的测定 （GB5009.82-2003) 维生素A： 存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中； 植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原; 包括A1和A2。 维生素E：,（第一法）HPLC测定VA和VE,一、原理 食品样品经皂化处理后，用有机溶剂将食品中的脂溶性维生素（如维生素A、维生素E）从不可皂化的部分提取出来，经过浓缩除去有机溶剂，再用适当的溶剂溶解后，用

6、HPLC法C18反相柱将VA和VE分离，经紫外检测器，用内标法测定其含量。,二、样品处理 （1）皂化： 称取适量样品（含VA30g,VE40g）于三角瓶中，加30mL无水乙醇，振摇使样品分散；加入5mL，100g/L抗坏血酸和2mL苯并e芘溶液（内标）混匀，加入10mL氢氧化钾(1:1) ，混匀，于沸水浴上 回流30min，使皂化完全（若有混浊现象，表示皂化完全），皂化后立即放入冰水中冷却；,（2）提取： 将皂化液移入分液漏斗，先用50mL水分2次洗涤皂化瓶（若有渣，可经过脱脂棉过滤），再用100mL无水乙醚分2次洗涤皂化瓶及残渣，所有乙醚洗液并入分液漏斗中，振摇两分钟（注意放气），静止分层后

7、，弃去水层；然后每次用100mL水将乙醚液洗至中性，需洗4-5次。,（3）浓缩： 将乙醚提取液经无水硫酸钠滤入150mL旋转蒸发瓶内，用约15mL 乙醚洗涤分液漏斗和无水硫酸钠2次，洗液并入蒸发瓶中，于55水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩余约2mL时，取下蒸发瓶，用氮气吹干乙醚，随即加入2mL乙醇，充分混合、溶解提取物。将乙醇移入塑料离心管中，于离心机上离心5min，上清液供色谱分析用。,三、所需主要仪器 高效液相色谱（带紫外分光检测器） 旋转蒸发器 高速离心机（带离心管） 恒温水浴锅 紫外分光光度计 说明：国标中用其来标定VA和VE的浓度,四、液相色谱分析 色谱参考条件： 预柱：ODS

8、 10m（4mmx4.5cm) 分析柱：ODS 5m（4.6mmx25cm) 流动相：甲醇：水98：2，混匀，临用前脱气； 紫外检测器波长：300nm，量程0.02； 进样量：20L; 流速：1.651.70mL/min,测定 （1）配制标准溶液 VA标准溶液：将VA标准品用无水乙醇溶解配制成浓度为1mg/ml; VE标准溶液:用无水乙醇分别溶解-生育酚、-生育酚、-生育酚3种标准品，配制成浓度为1mg/ml的标准液； 内标溶液：将苯并e芘用无水乙醇配制成浓度为10g/ml; （2）绘制标准曲线 将一定量的VA标准溶液、3种VE标准溶液和内标溶液混和均匀，对其混和液进行色谱分析，以维生素峰面积

9、和内标物峰面积之比为纵坐标，以维生素浓度为横坐标，绘制标准曲线（直线回归方程）。,（3）样品测定 取试样浓缩液20l注入色谱仪中，进行检测； 定性：用标准物色谱峰的保留时间定性； 定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰 面积的比值，以此比值由回归方程求出维生素含量； 五、结果计算 X：某种维生素的含量，mg/100g ：由标准曲线上查到的某种维生素含量，g/mL V：样品浓缩后定容体积,mL m：样品质量，g,水溶性维生素的理化性质 维生素B1的测定 维生素B2的测定 维生素C的测定,三、水溶性维生素的测定,易溶于水，不溶于大部分有机溶剂； 在酸性介质中稳定，在碱性条件下不稳定； 易受

10、空气、光、热、酶、金属离子的影响。,（一）水溶性维生素的主要理化性质,（二）维生素B1的测定,VB1又叫硫胺素、抗神经炎素 1、食品中VB1的存在形式 常以游离态存在； 复合脂形式存在（磷蛋白）； 辅羧酶形式存在 VB1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色 的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物 含量丰富。, VB1在中性、碱性下不稳定，易分解； VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定； VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。,2.VB1的性质,3.维生素B1的测定方法,紫外分光光度法: 适用于VB1含量高的样品,灵敏度和准 确度较差; 高效液相

11、色谱法 适用于食品中微量VB1的测定 荧光法 世界各国都用荧光法测定; 荧光法是我国国家标准分析方法（GB/T 5009.84-2003）, 原理： 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光，在一定条件下，其荧光强度与硫色素浓度成正比，即与硫胺素含量成正比。,（2）定量方法,标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。,(3). 操作步骤 试样处理 样品匀浆（或粉碎）于低温冰箱中冷冻保存。 提取 1) 水解 2) 酶解,吸附剂采用的是人造浮石。 将提取液加入人造浮

12、石交换柱中，VB1被吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，洗去杂质，最后用热的酸性氯化钾（25%KCl-HAC）把VB1洗脱下来，这样就得到纯VB1。,样品,热水,酸性氯化钾,收集酸性氯化钾定容, 净化, 氧化 静置 过滤 脱水, 荧光强度测定(通过荧光分光光度计可以测得) 激发波长365nm；发射波长435nm； 激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。 （4）方法说明 本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响硫色素荧光物质的样品； 酸解、水解的目的：使结合型的VB1成为游离型的； 紫外线会破坏硫色素，所以硫色素形成后，反应瓶要用黑布遮盖或在暗室中进行荧光测定

13、，并且要迅速测定；,维生素B2又称核黄素 测定方法主要有： 微生物法、荧光法、HPLC法 GB/T 5009.85-2003 荧光法（第一法） 微生物法（第二法）,（三）维生素B2的测定,荧光法测维生素B2,1.原理 核黄素在440500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(Na2S2O4)，将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。 为使VB2游离出来，采用需经酸解和酶解 为消除干扰，试样通过氧化处理和柱层析处理。,2.测定步骤 （1

14、）样品提取,称样,三角瓶,高压水解,盐酸溶液,调pH值,氢氧化钠溶液,酶解,淀粉酶,定容,蛋白酶,（2）氧化去杂,样品提取液,具塞试管,水,双氧水,冰乙酸,高锰酸钾,氧化去杂,褪色,标准液按相同方法进行,（3）柱层析,样品液,水,丙酮-乙酸-水混合液,水,收集洗脱液 定容,*标准液按相 同操作进行,（4）荧光测定 激发光波长440nm，发射光波长525nm，测量样品管及标准管的荧光值。 待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液中加0.1mL 20%低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。,3.计算 X：样品中核黄素含量，mg/100g A：试样荧光值 B：试样

15、空白荧光值 C：标准荧光值 D：标准空白荧光值 m：样品质量，g m1：标准管中核黄素含量g f：稀释倍数 100/1000：样品核黄素含量的换算系数,维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸; 广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。,（三）维生素C的测定,维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性；进一步水解则生成2，3 -二酮古乐糖酸，失去生理作用。 在食品中维生素C就是以还原型、脱氢型和二酮古乐糖

16、酸型这3种形式存在的；食品分析中的所谓总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括2，3 -二酮古乐糖酸和进一步氧化的产物。,维生素C 的测定方法,测定维生素C 的方法有： 荧光法，高效液相色谱法，2，4 二硝基苯肼比色法， 2，6 二氯靛酚滴定法，等 GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法 第一法：荧光法 第二法：2，4二硝基苯肼比色法,（1）原理： 试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹唔啉，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 注意：脱氢抗坏血酸可

17、与硼酸结合生成复合物，而不与邻苯二胺反应生成荧光物质，由此可以消除杂质的干扰。（空白试验）,（第一法）荧光法（测总抗坏血酸）,（2）试剂： 偏磷酸冰醋酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，加水稀释至500mL过滤后，贮存于冰箱中； 硫酸：0.15mol/L 偏磷酸乙酸硫酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用0.015molL-1硫酸稀释至500mL； 乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠溶解并稀释至1L； 硼酸乙酸钠溶液：称取硼酸9g，加入35mL乙酸钠溶液，用水稀释至1000mL； 邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺盐酸盐溶于100mL水中；,抗坏血酸标准溶液：准确称取0.500

18、g抗坏血酸溶于偏磷酸冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，吸取上述溶液5mL，再用偏磷酸冰醋酸溶液定容至50mL； 抗坏血酸标准使用溶液：100g/mL 百里酚蓝指示剂(麝香草酚蓝)：变色范围pH1.2(红)2.8(黄)； 活性炭：取50g活性炭加入250mL10%盐酸，加热至沸，减压过滤，用蒸馏水冲洗活性炭，检查滤液中无铁离子为止，于110120烘干。 （3）仪器：荧光分光光度计或具有350nm及430nm 波长的荧光计；捣碎机。,（4）操作步骤： 试样的制备：称取100克鲜样,加100mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入捣碎机内打成匀浆，先取少量样品加入1滴百里酚蓝，若显红色(pH=1.2)，即用

19、偏磷酸冰醋酸溶液定容至100mL；若显黄色(pH=2.8)，即用偏磷酸冰醋酸硫酸溶液定容至100mL，定容后过滤备用。 测定： 氧化处理：将上述滤液及抗坏血酸标准使用液各100ml转入三角瓶中加入12g活性炭振摇12分钟，过滤。即试样氧化液和标准氧化液，待测定。,各取10mL标准氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明“标准”及“标准空白” 各取10mL试样氧化液于2个100mL容量瓶中，分别标明“试样”及“试样空白” 于“标准空白”及“试样空白”中各加5mL硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至100mL，在4冰箱中放置23小时，即得“标准空白”溶液及“试样空白”溶液，备用。 于“

20、试样”及“标准”中各加5mL /L乙酸钠溶液，用水稀释至100mL,即得“试样”溶液及“标准”溶液，备用。,标准曲线的制备： 取上述“标准”溶液（抗坏血酸含量10g/mL）0.5、1.0、1.5和2.0mL标准系列，取双份分别置于10mL带盖试管中，再用水补充至2.0mL。（平行2次，做标准曲线） 取中“标准空白”溶液，“样品空白”溶液及 “样品”溶液各2mL，分别置于10mL带盖试管中。在暗室中迅速向各试管中加入5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发光波长338nm、发射光波长420nm处测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量

21、为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。,（5）结果计算： 式中 X-试样中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g； c-由标准曲线查得或由回归方程算得试样溶液浓度，g/mL m-试样的质量，g； V-荧光反应所用试样体积，mL； F-试样溶液的稀释倍数。,（第二法）2，4二硝基苯肼比色法 1.原理 先将样品中的还原型抗坏血酸用活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，加2，4二硝基苯肼生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比进行比色测定。,2.试剂 提取Vc用：20g/L草酸，10 g/L草酸 氧化处理用：活性炭（经HCl处理无铁离子） 控制氧化用：20g/

22、L硫脲、10g/L硫脲 显色用：20g/L2，4二硝基苯肼溶液，硫酸 1mg/mL抗坏血酸标准溶液 3.主要仪器 恒温箱或恒温水浴锅 紫外可见分光光度计 组织捣碎机,4.操作步骤 样品中Vc的提取和处理 提取（样品制备） 干样：样品（1-4g）+适量10 g/L草酸，磨成匀浆，用10 g/L草酸定容至100mL容量瓶。过滤，得提取液。 鲜样：样品+等量的20 g/L草酸，捣碎成匀浆，取1040g匀浆，用10 g/L草酸定容至100mL容量瓶。过滤，得提取液。 注意：不易过滤的样品，可离心沉淀后取上清液再过滤。,氧化处理 取25mL提取液+2g活性炭，振摇1min，过滤。要弃去初滤液； 取10mL氧化提取液+10mL20g/L硫脲； 此20mL氧化稀释液为待测液，相当于把提取液稀释了2倍。,（2）呈色反应 取3支带塞试管，各加入4mL氧化稀释液，留一支空白，另两支各加1.0mL20g/L2，4二硝基苯肼溶液，37恒温3h。 取出，空白管在室温下冷