反义核酸抗肝炎病毒研究进展

1、反义核酸抗肝炎病毒研究进展摘要病毒性肝炎的治疗一直是困扰人类的一个难题。目前可利用的药物仍屈指可数反义核酸技术的发展为箴病毒性肝炎的治疗带来了新的希望。利用赧反义DNA，反义RNA和核酶技术来抑锋制乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒和丁型肝钧炎病毒，在体外已进行了大量的研究，体瑶内也进行了一些研究，为临床应用反义核菝酸治疗病毒性肝炎奠定了基础。关键词酯反义核酸，抑制，肝炎病毒学病毒性肝炎是人类与其长期抗争的恶魔，迄今已发现有7种类型。由于病毒性肝炎的传染性拎强，尤其是乙型及丙型病毒性肝炎可形成舢慢性感染，造成肝细胞的持续损伤，加重肝脏病变，常导致病情反复发作，长期迁棒延不愈，部分病人可发展成肝硬化和肝

2、癌旧，危害极大。近年来，对病毒性肝炎的研扎究有较大的进展，但能有效治疗病毒性肝鳜炎的临床药物仍屈指可数，尤其是对慢性苷乙型及丙型病毒性感染，临床可用的药物仍是各型干扰素，对有选择性的病人来说爻，其治愈率也只有30401篙。因此寻找一种有效的抗肝炎病毒药物已锑成为迫在眉睫的问题。由于病毒的遗传物质不同于宿主细胞，从基因治疗的角度牲去发现新的抗病毒药物已成为近几年来的胪研究热点。反义核酸技术是一种新的基因顽治疗技术，包括反义寡核苷酸，反义RN槿A及核酶三大部分。反义寡核苷酸是一段鲔反义的DNA序列，能与特异性的靶序列情互补，抑制靶基因的表达。由于它特异性前强，毒副作用小而成为人们研究抗病毒药樾物的

3、热点。近几年来已有几种抗病毒反义额寡核苷酸药物进入临床试验阶段。反义R对NA是指一段与mRNA互补的RNA分子，是通过将正常cDNA反向插入到启动子下游后转录产生的。核酶是一种小的RNA分子，能以序列特异的方式在特定的位点断裂RNA分子，从而阻断特异蛋认白的表达。核酶的抗病毒作用也引起了研缕究者的广泛兴趣和关注。本文主要对近几年来应用反义寡核苷酸，反义RNA和核酶技术抗肝炎病毒的研究进展作一简要综觜述。1反义核酸抗乙型肝炎病毒病毒蚍性乙型肝炎以其感染面广，慢性化和难以苄治愈而成为临床治疗的难点。目前，全世迮界约有3亿人感染HBV，我国乙型肝炎病毒表面抗原的携带率占全国人口的，吓占全世界感染者的

4、13强。干扰素是目允前临床上唯一可用于治疗HBV感染的药园物，但治疗效果不好，随着反义寡核苷酸技术的产生和发展及对HBV基因结构，愫功能和复制等主要环节的认识和了解，应乎用ASON来抑制HBV基因的复制和表达在体外已进行了大量的研究，体内也进帽行了一些研究。体外研究主要采用转染了洋HBVDNA并能长期稳定分泌病毒的肝鬲癌细胞系进行的。分别针对HBV基因的吸附、转录、反转录、翻译和包装等阶段锕设计出各类ASON，体外抑制HBV的复制主要的靶部位有PreS、DR1畹、Pol、SP启动子转录mRNA帽区矫、S基因、C基因、PolyA增强信号区、RNA前导序列等，针对这些部位设擢计的ASON均能不同程

5、度的抑制HBs瀵Ag，HBeAg或HBcAg的表达，对病毒DNA也具有不同程度的抑制作用狄2，3。Korba等4针对以萋上不同部位合成了56条不同的硫代ASON，分别检测了它们对细胞中HBsA恒g，HBeAg，HBcAg及HBVD郭NA的抑制效果，结果表明：包含S基因容起始编码子的ASON均能有效抑制HBsAg的产生和病毒颗粒的释放，但不影细响细胞内HBV的复制；针对C基因的A丶SON能抑制病毒颗粒的产生和细胞内H沼BcAg和HBVDNA复制中间体的水平；针对HBV包装信号的茎环结构上游掠的ASON能最有效的抑制HBV的复制茸，但针对HBeAg和HBV聚合酶基因区的ASON却不能影响HBV的复

6、制。弊Goodarz等5针对HBV基因崭S区的5个位点设计了6段ASON，以峒molL的终浓度与PLCPRF5共同孵育72h后检测HBsAg的分屹泌量，结果发现，针对前4个位点设计的ASON对HBsAg有明显的抑制作用船，其中以S基因翻译起始区的作用最强，老抑制率达96。我国姚志强等6的馋研究也表明针对HBVmRNASP2增匪强子帽区，polyA增强信号区的硫代噪ASON能有效抑制HBsAg的产生，镙抑制率达8590，对HBeAg为的抑制率也近5060。国内还有缢其他一些单位也展开了类似的工作。由于豫缺乏一个很好的动物模型，对抗HBV反嚎义寡核苷酸的体内作用研究进展较慢。1免993年，Offe

7、nsperger等迕7第一次用针对PreS基因5区的反义寡核苷酸AS2以20g每克体梭重的剂量腹腔注射到鸭肝炎病毒感染的北诜京鸭中，连续10d，DHBV的复制几慊乎被完全抑制，血清中的DHBsAg及骛肝中的HbcAg也消失了。Moriy惯a8等用一个转染了的HBVX基因髭的肝癌小鼠做模型，将一段含HBVX基因起始编码子的硫代ASON腹腔注射到小鼠体内，每周3次，连续8周，能有效撷的抑制肝脏HBVX基因的表达，阻止小扑鼠癌细胞恶性化。这一研究表明针对HB屠VX基因的ASON也许可用于阻止HB喑V感染成肝癌。ASON的稳定性及透侧膜性是影响ASON作用的一个重要因素通过对ASON进行各种化学修饰能

8、有瀑效地提高它在细胞内的稳定性，这些修饰髦主要是对磷酸二酯键中的氧原子进行各种取代，包括用硫基、甲基、甲氧基、乙氧蜚基等取代，以提高ASON对核酸酶的抗玲性，硫代是目前最常用的修饰方式。ASON的透膜性直接影响到细胞摄入ASO羡N的量，因而是目前进行ASON研究的潺一个热点。在肝细胞的表面有独特的无唾凿液酸糖蛋白受体，将ASON连接到AS蓍GP-R配体上，能定向地将ASON导帼到肝细胞，增加肝细胞对ASON的摄取苠量9。目前人们已对许多肝细胞特异享的ASON载体进行了研究10，这濉为更进一步地进行反义寡核苷酸的体内和段临床研究奠定了基础。由于反义RNA能勾在转染的细胞中连续、稳定地表达，对整东

9、合的病毒能提供长期的治疗效应，因此这汨一技术也被用于抑制HBV的复制Wu扒等11构建了三个互补于HBsAg沦mRNA整个编码区，和5区的582宿bp的反义RNA表达质粒，在体外翻译系统，三个反义RNA均能以浓度依赖的跋方式抑制HBsAgmRNA的翻译，进钍一步将其克隆到哺乳动物细胞表达载体上岛，转染到Hep3B细胞，几乎完全阻抑蚯了HBsAg的产生，转染后抑制率持续10个月左右。在反义RNA表达的细胞鹅，HBVmRNA的水平显著低于对照细妃胞，这表明反义RNA抑制HBsAg合性成部分可能是通过降低HBVmRNA水疼平而起作用的。这一研究第一次证明了反惝义RNA对HBV基因表达的抑制作用，也为治

10、疗HBV感染提供了一条新的途径惭。利用核酶抑制HBV在体外也进行了莅一些研究。Beck等12针对HB坪V基因设计了几个锤头型核酶，在体外能彡有效的断裂HBV基因。将HBV表达质懔粒和核酶共转染到Huh7细胞中，发现嘧在细胞内核酶只能中等程度抑制HBV前穆基因组的产生，而当细胞裂解后，核酶能八有效的断裂HBV前基因组RNA，尤其当用蛋白酶K和酚抽提后，核酶的活性大樘大提高，这可能是由于细胞内存在着一些宄蛋白质，与基因结合，从而抑制了核酶与歙靶RNA的杂交；另外，细胞内Mg2的浓度太低也可能是影响核酶活性的一个原因总之，核酶在体内的活性是一个很莪复杂的问题，仍需进行大量的研究。2几反义核酸抗丙型肝

11、炎病毒丙型肝炎病毒呻为一正的单链RNA，与乙型肝炎病毒感璀染一样，HCV感染也易慢性化，并进一步发展成为肝癌估计世界上约有1的刍人感染了HCV，2040的病人将发展成肝硬化或肝癌。目前临床上可用迮于治疗HCV感染的较有效药物也只有干谩扰素。由于HCV基因的变异性较高，其变异性被认为是感染复发率高的一个原理因13，而其5非编码区是高度保吊守的，因此抗HCV的ASON大部分是针对这一部位设计的Wakita等陈14首先研究了ASON抗HCV的作用他们针对HCV5NCR的nt3圊865，134175，3123泪39合成了三段ASON，在一个无细胞蹩蛋白质合成系统中，能有效抑制病毒蛋白残的翻译，表明这些

12、区域对HCVRNA的仔翻译是重要的，但由于缺乏一个很好的细骝胞模型，这些ASON在细胞内的作用仍不请楚Mizutani等15发辋现一个嗜人T淋巴细胞病毒型感染的细胞系MT-2能支持HCV的复制他们跎用MT-2的研究表明：针对HCVC基庖因含起始编码子的一段ASON及其下游戋的一段序列均能特异地抑制HCV的复制臌，而针对起始编码子上游的一段序列则只姻有轻微的抑制作用Alt16的实费验也表明，针对HCV5NCRnt3疠26348的硫代反义核酸，在体外能嘱有效抑制受HCVRNA5NCR调控铠的报告基因荧光素酶的活性，当浓度为伶molL时，抑制率达96利用核骄酶抑制HCV的复制体外也进行了一些研筑究L

13、ieber等17针对HCV5端的高度保守区设计了6个锤头型核胱酶，用重组的腺病毒载体进行表达，联合扮或单独应用能有效抑制CHO细胞中HC滗VRNA的表达从慢性HCV感染者体内分离肝细胞进行培养，并转染含核酶的蹙腺病毒载体，也能有效降低HCVRNA，而且对来自二个由不同基因型HCV感埔染的病人的肝细胞都是有效的。由于腺病盔毒载体表达的产物能够在体内直接到达肝脏，因此，这一研究为临床上利用核酶治杈疗HCV感染提供了新的希望Welc弘h等18则针对HCV5非翻译区莒设计了4个发夹型核酶CR2、CR6、呈CR7、CR8，用HCV5NCR的漾nt38187这一片段作为底物，体掠外研究发现CR2能以时间依

14、赖的方式切极割底物，在作用2h，底物被切割，而暖当底物为HCV的nt38698时，呐CR2在体外的切割活性就很低，除非底蜕物在切割前预先进行变性，这可能是由于底物中存在二级结构，使核酶不能达到切纰割部位通过设计一些能减少底物RNA辆二级结构的RNA分子，能使CR2的活糜性增强35倍。另外，他们还针对HC着VRNA包被蛋白编码区设计了三个核酶耿，体外均能有效切割HCVnt386镯98的底物RNA。随后，他们构建了这绁些核酶的真核表达载体，分别在HT10殛80和HeLa细胞中分析它们的切割活芈性，结果表明能有效抑制报告基因抗性克笥隆的产生，在未感染的HepG2和HT矫1080细胞中稳定表达核酶能阻

15、止随后蕹的HCV感染。这些结果表明抗HCV核鞋酶在人中具有抑制HCV基因表达和感染倔的潜力，但核酶要应用到体内，仍需进行仵大量的研究。3反义核酸抗丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒是一缺陷型单股环状负舜链RNA病毒，需HBV的辅助方可感染录人体，其与HBV同时或重叠感染常导致丛肝炎慢性化或重型化。HDV是目前已知咭的唯一具有核酶活性的动物病毒，其基因巾链和抗基因链均具有自裂活性，核酶为假鳄结样结构，在HDV复制过程中起着关键亵的作用19，这从理论上为利用AS兽ON抑制核酶活性以阻断HDV复制提供了理论依据。用反义核酸阻断HDV感染踱在国外还未见报道。我们室和第三军医大痍学及302医院合作进行了这方面的工

16、作侨。我们在进行了中国人HDV核酶活性区歼cDNA克隆及序列分析，并构建了含H猎DV核酶cDNA片段的质粒的基础上，娟以HDV基因链核酶区具有重要作用的n棂t721735位核苷酸为封闭靶序列，设计合成了15聚的ASON，发现在体外能有效抑制112nt核酶催化的自河裂反应，并进一步对此ASON进行硫代帅修饰，观察其在HDV感染的树鼠树动物模型体内的作用，结果表明能较好地阻断外树鼠树体内HDV的感染20。这些设研究为深入进行ASON的抗丁型肝炎病貉毒作用及临床治疗提供了重要依据。综上所述，应用ASON技术抗肝炎病毒研珲究已取得了一些可喜的成绩，为进一步过度到临床应用奠定了基础。但由于该领域的研究毕

17、竟刚起步不久，仍有许多问题亟刭待解决ASON的修饰和导向仍是AS茫ON治疗研究中的二个重要问题。核酶虽靳能特异性切割病毒RNA，但要达到理想的治疗目的还需改善其透膜性和稳定性。对HBV和HCV来说，如何从众多的作肿用部位中筛选出最佳的ASON序列仍需进行大量的研究工作。ASON在体内的夏抗病毒活性可利用的资料仍很有限，对它拉们在体内的药动学、药效学、毒副作用、跏抗病毒活性评价等仍需进行探讨，建立更多合适的动物模型也极为迫切。另外，A郢SON的大量制备及成本问题也是影响A晡SON推广应用的二个关键问题尽管如堙此，ASON无疑为肝炎病毒的治疗带来剔了新的希望相信不久的将来，这些问题俯都将得到解决，

18、ASON将成为一种有效楚的抗肝炎病毒新药物。参考文献1W皤ongDKH，CheungAM，R汕ourkeK，etalEffect惨ofalpha-interferontreatmentinpatient俄swithhepatitisBant耔igen-positivechron芍ichepatitisBAnnIn沂ternMed，1993，119：3蹶123232Offensperg黉erwB，BlumHE，Gerokw滇Therapyofhepadnav觐irusinfectionusing锁antisenseoligonucl糕eotidesIntervirol辍ogy，1995，38：1

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