荧光探针设计原理

1、荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图11)：1识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。2信号报告基团(发色团, F)，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。3连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等

2、短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。图1.1 荧光探针的结构1.1.1 荧光探针的一般设计原理(1) 结合型荧光探针21图1.2 共价连接型荧光探针结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中，必须充分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、合成：考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量

3、子产率，有利于提高检测的灵敏性），Stokes 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象），荧光发射最好要在长波长区（最好位于500 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰，另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力等）作为理论指导，多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(c) 荧光超分子受体的组装：组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起，要充分考虑到识别基团和荧

4、光基团之间能通过连接基进行信号传递，对识别对象的识别信息（如荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等）可以及时传递出去。图1.3 共价连接型锌离子荧光探针De Silva 在1997年报道的化合物1 22是一个典型的共价连接法设计的荧光探针。它分别以有优良光学性质的蒽作为荧光基团，以对Zn2+有特异性识别的基团双( 2-吡啶甲基)氨 (DPA)为识别基团，通过亚甲基将识别基团和荧光报告基团连接在一起。通过对比加锌前后荧光强度的不同实现了对锌离子的检测。(2) 置换型荧光探针图1.4 置换型荧光探针利用该方法设计的荧光探针是通过识别基团分别与荧光指示剂和被分析物结合能力的强弱来实现对被分析

5、物的检测。该类传感器对识别基团和荧光指示剂的要求都比较高，既要选择能和识别基团结合但结合能力又不是特别强的荧光指示剂，又要设计对被分析物能特异识别的识别基团。该类设计方法多用于阴离子传感器的设计。2002 年，Kim小组23设计了邻苯二酚紫作为荧光指示剂，双锌配合物为HPO42- 识别基团，并将二者自组装成化合物2，用于中性条件下水溶液中HPO42-的检测。加入识别客体 HPO42- 后，由于 HPO42- 与双锌配位能力强于邻苯二酚紫，从而把邻苯二酚紫挤开，使之进入溶液，表现为其原来颜色。在识别过程中，溶液颜色从蓝色变为黄色，常见的 Ac-、CO32-、NO3-、N3-、ClO4-、S2-、

6、F-、Cl-、Br-都不影响 HPO42- 的检测，表现出较好的选择性。图1.5 置换型HPO42-化学传感器(3) 化学计量型荧光探针（chemodosimeter）化学计量型荧光探针分子是利用探针分子与识别客体之间特异不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行检测的一类探针24。主要包括两种类型：一类是目标离子和探针分子发生化学反应后仍旧通过共价键相连接:另一类是目标离子催化了一个化学反应（图1.6）。图1.6 化学计量法的两种类型一般而言，化学计量型荧光探针分子都具有专一性和不可逆性。尽管这类探针已有不少报道,但由于设计较为困难和反应不够灵敏等缺陷而进展较为缓慢。图1.7 氨

7、基酸荧光分子探针Kim和Hong等25设计的识别半胱氨酸及高半胱氨酸的荧光分子探针3， 属于第一种类型。他们利用半胱氨酸及高半胱氨酸与醛生成五元噻唑环或六元噻嗪环的特异反应以及反应前后化合物3和4荧光性质的显著差异实现了对半胱氨酸及高半胱氨酸的高选择性检测。化合物 526 是较早应用化学反应原理实现检测客体的荧光探针，属于第二种类型。化合物5的乙腈溶液中加入汞离子后荧光显著增强(34倍)并红移，进一步用质谱检测发现生成了脱硫产物6。图1.8 基于汞脱硫原理的汞离子荧光探针1.1.2 荧光分子探针的响应机理目前，荧光分子探针的响应机理主要有以下几种：光致电子转移（PET, photo-induc

8、ed electron transfer）、分子内电荷转移（ICT, intramolecular charge transfer）、荧光共振能量转移（FRET, fluorescence resonance energy transfer）等。(1) 光诱导电子转移原理（PET）光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移的过程。典型的光致电子转移荧光探针体系是由具有电子给予能力的识别基团R通过连接基团S和荧光基团相连组成的功能分子。一般情况下，荧光分子探针的识别基团是电子给体，荧光基团是电子受体，并且通常情况下多采用含有氨基的基团作为识别基团。具

9、体PET工作过程如下：在识别基团与待测物种结合之前，当荧光基团受激发，具有给电子能力的识别基团能够使其处于最高占据轨道的电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，导致荧光基团的荧光猝灭。而识别基团与待测物种结合之后，由于降低了识别基团的给电子能力，光致电子转移过程被减弱或者不再发生，荧光基团的荧光发射得到恢复（如图1.9）。 图1.9 荧光分子光致电子转移的“开”“光”过程示意图。由于与待测物种结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开”状态，因此这类荧光分子探针又被称为荧光分子开关。PET荧光分子探针的作用机制可由前线轨道理论2

10、来进一步说明（见图1.10）。从图可以看出，识别基团处于自由态时，其HOMO轨道上的电子可以向荧光基团的HOMO轨道上转移，致使荧光基团被激发到LUMO上的激发态电子不能返回基态而难以产生荧光，此过程对应于发生PET现象。在识别基团与待测物种结合后，识别基团上的HOMO电子已无法转移到荧光基团的HOMO轨道上，使PET过程无法进行，这时荧光基团的激发态电子可以返回基态，产生荧光。由此可见，利用识别基团对PET过程的控制可以实现对体系荧光发射状态的调控。图1.10 光致电子转移机制机制的前线轨道理论解释。化合物1是一个非常典型的PET机理荧光增强型的例子。锌离子不存在时，由于识别基团中氮原子上的

11、孤对电子能够在荧光基团受激发态时占据激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，导致荧光基团的荧光猝灭，即发生了光致电子转移（PET）。当Zn2+存在时，Zn2+离子与两个吡啶氮及氨基配位，束缚了氮上的孤对电子，使发生在氮原子和荧光团之间的 PET 过程被禁阻，荧光强度大幅度增强实验结果也证实了此过程。在乙腈溶液中，加入Zn2+ 离子之前，化合物1的荧光量子产率仅为 0.01；加入Zn2+离子之后，它的荧光量子产率为0.77，荧光增强了77 倍。(2) 分子内电荷转移( ICT )机理分子内电荷转移荧光探针分子通常由富电子基团（电子给体）和缺电子基

12、团（电子受体）共轭相连，形成推-拉作用的共轭体系，没有 PET 探针分子那样明显的连接基。也就是说荧光团F和受体R通常融合在一起，识别过程二者同时参与。当受体结合被分析物后，作为受体的供电子部分或拉电子部分的供拉电子能力被改变，整个共轭体系的p电荷重新分布，荧光团的推-拉作用被抑制或强化，进而导致吸收光谱、激发光谱以致发射光谱发生红移或蓝移（如图1.11）27。化合物7 28两端分别含有羰基、苯并噻唑两个强拉电子基和两个氨基强供电子基团，激态时荧光团能够有效地实现了从供体到受体的整个体系p电荷分离，是典型的ICT机理的荧光分子探针。当汞离子存在时，四氨基识别基团捕获Hg2+离子, 6, 7 位

13、氮的供电子能力大大减弱，减弱了整个体系p电荷分离程度，引起吸收波谱和荧光光谱分别蓝移了60 nm 和92 nm ，荧光颜色由蓝色变为黄色，同时实现了比色及比率型Hg2+离子的检测。图1.11 识别基团分别为电子供体和电子受体的ICT过程光谱移动示意图图1.12 具有D-A结构的ICT汞离子荧光探针(3) 荧光共振能量转移(FRET)机理荧光共振能量转移是指当一对合适的能量给体分子(Donor)和受体分子(Acceptor)相距一定距离(一般为2-5 nm)，且给体的发射光谱与受体的吸收光谱能有效重叠时，处于激发态的给体将把一部分或全部能量转移给受体，使接受体被激发的过程。受体可以是荧光物质也可以是只有吸收而没有发射的荧光猝灭剂。根据Frster理论，共振能量转移效率可以用式 1.5 表示29: (1.5)式中R为两个荧光基团的距离，R0为Frster距离(供体-受体之间的临界转移距离)。从这个方程可以看出，即使R的微小变化都会导致能量转移的效率强烈改变24-26。图1.13具有D-A结构的FRET汞离子分子荧光探针利用FRET效率对距离的强的依赖性，FRET广泛应用于蛋白质和核酸的结构及动力学研究、分子结合的测定等领域30。同样，能量共振转移原理也被用于荧光分子探针的设计。20