分子生物学基础第4章遗传信息的转录从DNA到RNA

1、分子生物学基础,第四章,遗传信息的转录,从,DNA,到,RNA,第一节,RNA,转录的概述,一,RNA,转录的特点,在,DNA,指导下,RNA,的合成称为转录,RNA,链的转,录起始于,DNA,模板的一个特定起点，并在特定的终,点终止，此转录区域称为转录单位。一个转录单,位可以是一个基因或多个基因。基因的转录是一,种有选择性的过程，随着细胞的不同生长发育阶,段和细胞内外条件的改变将转录不同的基因。转,录起始主要由,DNA,分子上的启动子,promoter,控,制，而控制终止的部位称为终止子,teminator,典型的转录单位结构如图,4-1,第一节,RNA,转录的概述,图,4-1,典型的转录单

2、位结构,第一节,RNA,转录的概述,二、转录的基本过程,无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板识别,转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止（图,4-2,图,4-2,大肠杆菌中依赖于,DNA,的,RNA,转录过程,第一节,RNA,转录的概述,1,模板识别,模板识别阶段主要指,RNA,聚合酶与启动子,DNA,双链相互,作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的,DNA,链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板,DNA,的,碱基配对。转录起始就是,RNA,链上第一个磷酸二脂键的产,生,2,转录起始,转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启动,子,酶复合物相结合构成新生,RNA

3、,的5端，再以磷酸二酯,键的形式与第二个核苷酸相结合，起始的终止反应在,因,子的释放。过去认为磷酸二酯键的形式就是转录起始的终,止，实际上，只有当新生,RNA,链达到,69,个核苷酸时才能形,成稳定的酶,DNA,RNA,三元复合物，才释放,因子，转录进,入延伸期,第一节,RNA,转录的概述,3,通过启动子,转录起始后直到形成,9,个核苷酸短链是通过启动子阶段，此时,RNA,聚合酶一直处于启动子区，新生的,RNA,链与,DNA,模板链的结合不够牢固,很容易从,DNA,链上掉下来并导致转录重新开始。一旦,RNA,聚合酶成功地,合成,9,个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段,所以，通

4、过启动子的时间代表一个启动子的强弱,4,转录延伸,RNA,聚酶离开启动子，沿,DNA,链移动并使新生,RNA,链不断伸长的过,程就是转录的延伸。大肠杆菌,RNA,聚合酶的活性一般为每秒合成,50-90,个核苷酸。随着,RNA,聚合酶的移动,DNA,双螺旋持续解开，暴露出新的,单链,DNA,模板，新生,RNA,链的,3,末端不断延伸，在解链区形成,RNA,DNA,杂合物。而在解链区的后面,DNA,模板链与其原先配对的非模板链重,新结合成为双螺旋,5,转录终止,当,RNA,链延伸到转录终止位点时,RNA,聚合酶不再形成新的磷酸二,酯键,RNA,DNA,杂合物分离，转录泡瓦解,DNA,恢复成双链状态

5、，而,RNA,聚合酶和,RNA,链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止,第一节,RNA,转录的概述,三,RNA,聚合酶,1,原核生物的,RNA,聚合酶,大多数原核生物,RNA,聚合酶的组成是相同的（表,4-1,，大肠杆菌,RNA,聚合酶由,2,个,亚基、一个,亚基、一个,亚基和一个,亚基组,成，称为核心酶。加上一个,亚基后则成为聚合全酶,holoenzyme,相对分子质量为,4.65,10,5,图,4-3,第一节,RNA,转录的概述,2,真核生物的,RNA,聚合酶,真核生物的基因组比原核生物大,RNA,聚合酶也更为复杂。其相,对分子质量大都在,5,10,5,左右，有,814,个亚基，并含有,

6、Zn,2,利用,鹅膏蕈碱,amanitine,的抑制作用可将真核生物,RNA,聚合酶为分,三类（表,4-2,第二节,启动子与转录的起始,一、启动子的基本结构,启动子是一段位于结构基因,5,端上游区的,DNA,序列,能活化,RNA,聚合酶，使之与模板,DNA,准确地相结合并具有转,录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动,子能否有效地形成二元复合物，所以,RNA,聚合酶如何有,效地找到启动子并与之相结是转录起始过程中首先要解决,的问题。有实验表明，对许多启动子来说,RNA,聚合酶与,之相结合的速率至少比布朗运动中的随机碰撞高,100,倍,第二节,启动子与转录的起始,1,原核生物的启动子

7、结构,原核生物启动子序列按功能的不同可分为,3,个部位（图,4-4,上,1,起始部位：指,DNA,分子上开始转录的作用位点，该位点有与,转录生成,RNA,链的第一个核苷酸互补的碱基，由前述内容可知，该碱,基的序号为,1,2,结合部位：是,DNA,分子上与,RNA,聚合酶的核心酶结合的部位,其长度为,7bp,中心部位在,10bp,处，碱基序列具有高度何守性，富含,TATAAT,序列，故称之为,TATA,盒,TATA box,，又称普里布诺序列,pribnow box,。因该段序列中富含,AT,碱基，维持双链结合的氢键,相对较弱，导致该处双链,DNA,易发生解链，有利于,RNA,聚合酶的结合,3,

8、识别部位：利用诱变技术可使启动子发生突变，当,35,序列,突变时，将会降低,RNA,聚合酶与启动子的结合速度，这说明,35,序列提,供了,RNA,聚合酶识别的信号，该序列的碱基富含,TTGACA,其中心则刚,好位于,35bp,处，它是,RNA,聚合酶,亚基的识别部位,第二节,启动子与转录的起始,图,4-4,原核和真核生,物的启动子结构,第二节,启动子与转录的起始,2,真核生物的启动子结构,科学家通过对许多基因启动子区的分析，发现绝大多,数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式。简单地,说，真核基因的启动子（图,4-4,下）在,25,35,区含有,TATA,序列，在,70,80,区含有,CCA

9、AT,序列,CAAT box,在,80,110,含有,GCCACACCC,或,GGGCGGG,序列,GC box,。习,惯上，将,TATA,区上游的保守序列称为上游启动子元件,upstream promoter element,UPE,或称上游激活序列,upstream activating sequence,UAS,第二节,启动子与转录的起始,3,真核生物启动子对转录的影响,TATA,区和其他两个,UPE,区的作用有所不同（图,4-5,前者的主要作用是使转录精确地起始，如果除去,TATA,区或,进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如,CAAT,区或,GC,区,突变后明显，但发现所获得的,RN

10、A,产物起始点不固定。研,究,SV40,晚期基因启动子发现上游激活区的存在与否，对该,启动子的生物活性有着根本性的影响。若将该基因,5,上,游,21,47,核苷酸序列切除，基因完全不表达（图,4-6,第二节,启动子与转录的起始,图,4-5,启动子区主要顺式作用元件与基因转录活性,第二节,启动子与转录的起始,图,4-6 SV40,基因启动子上,TATAAA,及邻近区域对基因,转录活性的影响,第二节,启动子与转录的起始,二、转录的起始,1,启动子区的识别,2,原核生物转录的起始,原核生物转录起始过程（图,4-7,RNA,聚合酶在,亚,基引导下，识别并结合到启动子上，使,DNA,局部的双链被,解开，

11、形成的解链区称转录泡,transcription bubble,解链发生在与,RNA,聚合酶结合的部位,RNA,聚合酶的催化亚,基按照模板链对碱基的选择，特异识别底物核苷酸，形成,磷酸二酯键并脱下焦磷酸，合成,RNA,链最初,29nt,第一个,核,苷,酸,通,常,为,带,有,3,个,磷,酸,基,的,鸟,苷,或,腺,苷,pppG,或,pppA,。起始合成后,亚基脱离核心酶与启动子，起始,阶段至此结束,第二节,启动子与转录的起始,图,4-7,原核生物基因转录的起始,第二节,启动子与转录的起始,3,真核生物转录的起始,除了,RNA,聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少,还需要,7,种辅助蛋白质因子

12、参与（表,4-3,。因为不少辅助,因子本身就包含多个亚基，所以转录起始复合物的分子量,特别大,真核生物转录起始过程（图,4-8,：在,7,种辅助因子参,与下,RNA,聚合酶与启动子相互作用，聚合酶首先与启动,子区闭合双链,DNA,相结合，形成二元闭合复合物，然后经,过解链得到二元开链复合物。解链区一般在,9,13,之间,而酶与启动子结合的主要区域在其上游。一旦开链区解链,酶分子能以正确的取向与解链后的有关单链相互作用，形,成开链复合物。因此,RNA,聚合酶既是双链,DNA,结合蛋白,又是单链,DNA,结合蛋白,DNA,开链是按照,DNA,模板序列正确,引入核苷酸底物的必要条件,第二节,启动子与

13、转录的起始,第二节,启动子与转录的起始,图,4-8,真核生物,RNA,聚合,酶指导的基因转录起始,第二节,启动子与转录的起始,三、增强子及其功能,除了启动子以外，近年来发现还有另一序列与转录的,起始有关。在,SV40,的转录单元上发现它的转录起始位点上,游约,200bp,处有两段,72bp,长的重复序列，它们不是启动子,的一部分，但能增强或促进转录的起始，除去这两段序列,会大大降低这些基因的转录水平，若保留其中一段或将之,取出插至,DNA,分子的任何部位，就能保持基因的正常转录,因此，称这种能强化转录起始的序列为增强子或强化子,enhancer,。除,SV40,外，还在反转录病毒基因、免疫球,

14、蛋白基因、胰岛素基因、胰糜蛋白酶基因等许多基因的启,动区中陆续发现了增强子的存在,第三节,转录的终止,一、不依赖于,因子的终止,现已查明，模板,DNA,上存在终止转录的特殊信号,终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子,终止位点上游一般存在一个富含,GC,碱基的二重对称区，由,这段,DNA,转录产生的,RNA,容易形成发卡式结构。在终止位点,前面有一段由,48,个,A,组成的序列，所以转录产物的,3,端,为寡聚,U,这种结构特征的存在决定了转录的终止。在新,生,RNA,中出现发卡式结构会导致,RNA,聚合酶的暂停，破坏,RNA,DNA,杂合链,5,端的正常结构,RNA3,端寡聚,U,

15、的存在,使杂合链的,3,端部分现不稳定的,rU,dA,区域。两者共同作,用使,RNA,从三元复合物中解离出来（图,4-9,。终止效率与,二重对称序列和寡聚,U,的长短有关，随着发卡式结构（至,少,6bp,和寡聚,U,序列（至少,4,个,U,长度的增加，终止效率,逐步提高,第三节,转录的终止,二、依赖于,因子的终止,体外转录实验表明，纯化的,RNA,聚合酶并不能识别特,异性的转录终止信号，而加入大肠杆菌,因子后该聚合酶,就能在,DNA,模板上准确地终止转录,因子是一个相对分,子质量为,2.0,10,5,的六聚体蛋白，它能水解各种核苷三磷,酸，实际上是一种,NTP,酶，它通过催化,NTP,的水解促

16、使新生,RNA,链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录,依赖于,因子的转录终止区,DNA,序列缺乏共性，说明,该因子并不能识别这些终止位点。现在一般认为,RNA,合,成起始以后,因子即附着在新生的,RNA,链上，靠水解,ATP,产,生的能量，沿着,5,3,方向朝,RNA,聚合酶移动，到达,RNA,的,3,OH,端后取代了暂停在终止位点上的,RNA,聚合酶,使之从模板,DNA,上释放,mRNA,完成转录过程（图,4-10,第三节,转录的终止,图,4-11,依赖于蛋白质因子的转录抗终止模式,第四节,转录后加工,一,mRNA,的加工,1,5,端帽结构,目前所知,5,端帽结构是在核内完成的，且先于

17、对,mRNA,中段序列的剪接过程，加帽的作用部位是转录后的,mRNA 5,端的第一个核苷酸上。由前面内容所知,RNA,5,端的第一个核苷酸以嘌呤类多见，尤以,pppG,为主，其,作用过程为：先由磷酸酶把,5,pppG,水解生成,5,pG,然,后与另,一个三磷酸鸟苷,pppG,反应生成三磷酸双鸟苷，接着在,甲基化酶的作用下，由,SAM,提供甲基，将甲基连接在后接,上去的鸟嘌呤碱基,N,7,位上，生成,5,m,7,GpppGp,此结构称帽,子结构（图,4-12,第四节,转录后加工,图,4-12,真核生物,mRNA5,端帽结构,第四节,转录后加工,2,3,端加尾,真核生物成熟的mRNA 3,端通常都

18、有,100200,个腺苷,酸残基，构成多聚腺苷酸,polyA,的尾巴。通过研究发,现,DNA,序列中没有多聚,T,的序列，由此说明了3尾巴,polyA,是在转录后加上的。研究发现，它还是多聚腺苷酸,化的信号，该序列,AAUAAA,因为切除该保守序列，3,端,则不能进行切除，也不能形成,polyA,尾巴。3,端,polyA,尾,的形成见图,4-13,第四节,转录后加工,图,4-13,真核生物,mRNA3,端,polyA,尾结构的形成,第四节,转录后加工,3,mRNA,中段序列的剪接,真核生物细胞作为转录的模板链中的结构基因中含有,表达活性的碱基序列，称外显子,exon,，也有无表达活,性的碱基序

19、列，称内含子,intron,，其后者远多于前者,经转录生成的,hnRNA,既有内含子序列，也有外显子序列,剪接在加帽加尾后进行，由核酸内切酶把内含子和外显子,的连接处的磷酸二酯键水解，剔除内含子，再连接外显子,生成成熟的,mRNA,图,4-14,。此后,mRNA,通过核膜孔转运,到细胞质，指导蛋白质的合成。剪接过程比较复杂，其内,含子一般左端为,GU,右端均为,AG,此结构形式不适用于线,粒体和叶绿体的内含子，也不适合于,tRNA,和,rRNA,的编码基,因，该结构可能为核酸内切酶的作用位点。体外实验表明,切开首先在内含子左端,GU,外进行，进行一系列反应过程再,在内含子右端,AG,处切开（图

20、,4-15,第四节,转录后加工,图,4-14,卵清蛋白,mRNA,的剪接加工过程,17,外显子,AG,内含子,第四节,转录后加工,图,4-15,前体,mRNA,中内含子的剪切位点,第四节,转录后加工,二,tRNA,加工,1,原核生物,tRNA,的加工,1,核酸内切酶与,DNA,限制性内切酶不同，它不能识,别特异的序列，所识别的是加工部位的空间结构,2,核酸外切酶从,3,端逐个切去附加序列,3,3,端,CCA,OH,结构,所有成熟的,tRNA,的,3,端都,有,CCA,OH,结构,4,修饰碱基的形成,成熟的,tRNA,含有大量的稀有碱,基，如甲基化碱基、二氢尿嘧啶等。这些都是由高度特异,性的,t

21、RNA,修饰酶作用形成的,第四节,转录后加工,图,4-16 tRNA,前体的加工,第四节,转录后加工,2,真核生物,tRNA,的加工,真核生物,tRNA,基因数目比原核生物,tRNA,基因数目大得,多，不过其基因也成簇排列，并且被间隔区分开,tRNA,前,体由,RNA,聚合酶转录合成，前体加工成成熟的,tRNA,需要在,核酸内工酶和外切酶作用下切除,5,和,3,端的附加序列,真核生物,tRNA3,端不含,CCA,OH,结构。成熟,tRNA,还需要进,行碱基修饰，修饰反应的形式有甲基化反应、还原反应,脱氨基反应和碱基转位反应,tRNA,前体中也有内含子成分,在核酸内切酶作用下，切去内含子，再由,

22、RNA,连接酶催化,使切开的,tRNA,两部分连接起来。另有报道，成熟,tRNA,的反,密码子环是通过加工插入,tRNA,前体中的,第四节,转录后加工,三,rRNA,加工,原核生物中,rRNA,的加工往往与转录同时进行，因此一,般得不到完整的前体,rRNA,负责其前体加工的核酸内切酶,为,RNaseIII,图,4-17,，在该酶的作用下,30S,转录产物,裂解产生,16S,和,23S rRNA,前体,5S rRNA,的前体是在,RNaseE,作用下产生的,真核生物,rRNA,基因拷贝数很多，呈串联排列，重复达,成千上万次。在分类上，把,rRNA,基因,rDNA,序列称为高,度重复的,DNA,序列。由,RNA,聚合酶,I,转录产生,45S rRNA,前体,在,RNaseIII,和其他核酸内切酶作用下，生成,18S,5.8S,和,28S rRNA,经过适当加工后,28S,5.8S,5S rRNA,以及,有关蛋白一起组成核糖体大亚基,18S rRNA,与有关蛋白组,成小亚基（图,4-18,第四节,转录后加工,图,4-17,大肠杆菌,rRNA,前体的加工,第四节,转录后加工,图,4-18,真核生物,rRNA,前体的加工,第四节,转录后加工,四、核酶的作用特点及方式,1,核酶的作用特点,1,核酶的作用底物比较单纯，均为,RNA,也就是说,核酶一般多限于催化自身的,R