PCR常见问题分析及解决策略ppt课件

1、PCR常见问题、原因分析及其对策,PCR技术简介,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,提高PCR反应特异性的策略,临床PCR检测的常见问题,定量PCR常见问题,PCR标准反应体系,DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2浓度 dNTPs dH2O 耐热聚合酶,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯 度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓 度 加量过多导致非特异性扩增增加,引 物,特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓 度 应适当,过高导致非特异性增加, 过低则扩增产物 太少,反应体系对PCR扩增的影响,过高非特异性严

2、重 过低无扩增产物,浓度适当 避免反复冻融,pH值适当 避免污染,pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂,反应缓冲液,dNTPs,dH2O,Mg 2浓度,如何选择最合适的DNA聚合酶,PCR用耐热DNA聚合酶,Taq酶,pfu酶,Hotstart Taq酶,混合酶,Taq plus,Long Taq,Taq platinum,特异性-基因组扩增、RT-PCR,保真性-基因筛选、测序、克隆,长片段扩增-构建基因图谱、测序等,扩增效率-复杂模板扩增（GC含量高、二级结构,PCR试剂盒-复杂模板扩增、大规模基因检测,如何选择最合适的DNA聚合酶 -根据PCR实验需求,PCR常见问题之一-无扩增产物,现象

3、：正对照有条带，而样品则无,M 1 2 正对照,原 因,模板含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间,对策,PCR常见问题之二-非特异性扩增,现象： PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带,原 因,对策,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多,重新设计引物

4、或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数,PCR常见问题之三-拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态,M 1 2,原 因,对策,模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数,PCR常见问题之四-假阳性,现象：空白对照出现目的扩增产物,原 因,靶序列或扩增产物的交叉污染,对策,操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所

5、有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存,提高PCR反应特异性策略,巢式PCR（Nest-PCR,递减PCR（TouchDown PCR,热启动PCR（HotStart PCR,使用PCR增强剂,策略之一巢式PCR,PR1,PF2,PR2,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性,策略之二递减PCR,递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约

6、5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等,策略之三热启动PCR,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度； 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一,策略之四使用PCR增强剂,甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。

7、 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 增强剂浓度要适当,荧光定量PCR常见问题,荧光定量PCR扩增效率确认,相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率：-3-3.5 PCR扩增效率（E）：0.91.2 重复性好：STD 0.2 特异性好,荧光定量PCR常见问题,无Ct值（信号）出现 或出现过晚,阴性对照出现 明显的扩增,荧光PCR mix或水污染； 出现引物二聚体：设计特异性引物,反应循环数不够； 检测荧光信号步骤有误； 引物、探针设计不佳或降解； 模板量少或降解。 反应条件或体系不佳：优化； 扩增片段过长：100200bp,荧光定量PCR常

8、见问题,溶解曲线不止一个主峰,引物设计不佳：设计特异性引物； 引物浓度不适：降低引物浓度； 退火温度低：调整退火温度； 镁离子浓度过高：降低镁离子浓度； 模板中有基因组污染：注意提取过程； 耗材仪器不匹配； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照,荧光定量PCR常见问题,扩增效率低,重复性不好,反应体系中部分成分尤其是荧光染料降解； 反应条件不佳：延长退火、延伸时间，改为三步法， 降低退火温度，提高引物浓度，重新设计引物； 反应体系中有抑制物：一般为模板引入,加样不准确； 仪器温度均一性不好； 模板浓度低,荧光定量PCR常见问题,扩增曲线不正常,基线等设置不当：减小基线终点； 模板量过多：将模板稀释

9、,临床PCR检测的常见问题,假阳性问题,假阴性问题,定量问题,方法学问题：靶基因序列特异性、引物错配、非特异性扩增 污染问题：样本污染、产物污染,试剂因素 操作因素 仪器因素 标本因素,外标定量与内标定量,临床PCR检测常见问题解决办法,严格区分及实验人员培训； 使用UNG技术,假阳性解决办法,假阴性解决办法,设置阳性对照监测试剂问题； 降低操作难度，提高操作人员素质； 阳性对照、标准曲线或使用内对照监控仪器故障； 使用抗干扰能力强的试剂提取样本DNA,临床PCR检测常见问题解决办法,外标定量与内标定量,RT常见问题,RNA降解或起始量少 RNA含抑制成分 cDNA 5端不全 目的基因在组织中不 表达或表达量太低,原因,对 策,分离高质量的RNA 使用高温逆转录酶，如RT007（BioFlux） 使用随机引物或GSP 尝试其它组织,问题1：RT-PCR没有产物,六种Taq和MasterMix： Taq、Pfu、HotStart Taq、Taq plus、Long Taq、Taq Platinum dNTP 引物 SP6,Tn7,M13,S