试剂盒提DNA的原理

1、最新 料推荐基因组 dna提取试剂盒简介dna是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等试验，获得高分子量和高纯度的基因组dna是非常重要的前提， 因此基因组dna的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。solarbio 公司提供各种不同样品基因组 dna提取试剂盒，如植物、动物、细菌、细胞、血液、酵母等基因组 dna提取试剂盒。所提取的基因组纯度高，片段大小在 50kb 左右。用户可根据需要选用不同的试剂盒来进行不同样品的抽提。一、基因组 dna提取的原则1、保证核酸一级结构的完整性( 因为遗传信息全部储存在

2、核酸一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基层) 。2、排除其它分子 ( 如蛋白质、多糖 , 、脂类、有机溶剂等 ) 的污染，使下游试验顺利进行。二、基因组 dna提取的原理和方法dna与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，即染色丝，染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中，1最新 料推荐外有核膜及胞膜。从组织中提取 dna必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜， 使染色体释放出来， 同时去除与 dna结合的组蛋白及非组蛋白。1、样品预处理从各种不同来源的样品 ( 如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等 ) 中提取高纯度的基因组 dna，因细胞

3、结构及所成分不同，样品预处理方式也不同，以下简单介绍常用提取材料的预处理方式， 若需详细了解，请参考本公司各基因组 dna提取试剂盒说明书。部分样品预处理方式植物材料液氮研磨动物材料匀浆、液氮研磨培养细胞蛋白酶k 处理细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液红细胞裂解液去红细胞2、细胞裂解ctab法：2最新 料推荐适用于植物组织、真菌等。ctab是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7m nacl) 是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。sds法：适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。sds是一

4、种阴离子去污剂， 可溶解细胞膜，裂解细胞，使蛋白质变性、染色体解析。其它裂解方法：物理方式：机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解等酶法：蛋白酶 k3、dna分离纯化纯化要求：核酸样品中不应存在对酶 ( 如核酸内切酶、 dna聚合酶等 ) 有抑制作用的成分。其它生物大分子如蛋白质、 多糖、多酚和脂类分子等污染应降低到最低程度。排除其它核酸分子的污染，如提dna时应去除 rna，反之亦然。3最新 料推荐纯化方法：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化dna，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。 因硅基质材料可特异吸附核酸 dna，使用方便、快捷，不需要使用有

5、毒溶剂如酚、氯仿等，使得提取基因组像过滤一样简单，因此硅基质材料成为大规模分离纯化dna的通用方法。硅基质材料吸附核酸的原理：主要利用dna在高盐低 ph 值环境下与硅基质材料相结合， 在低盐高 ph值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后， 再水化的硅石破坏了基质和dna之间的吸引力， 因而dna从硅基质上被洗脱下来。注意事项：尽量简化操作步骤， 缩短提取过程， 以减少各种有害因素对核酸的破坏。减少化学物质对 dna的降解，为避免过酸、 过碱对 dna双链中磷酸二酯键的破坏，操作多在 ph值 4.0-10.0 的条件下进行。防

6、止基因组 dna的生物降解，主要是dnase降解基因组 dna，dnase4最新 料推荐需二价金属阳离子如mg2+等的激活，可用 edta等金属离子螯和剂螯和 mg2+以抑制 dnase的活性。减少物理因素对 dna的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力 ( 如剧烈振荡、搅拌等 ) ，细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂，dnase大量释放，样品反复冻融和高温等。4、dna洗脱收集dna的洗脱效率取决于以下重要因素：洗脱液成分：采用硅基质膜吸附的 dna，可将 dna在低盐高 ph值条件下洗脱下来。ph值在 7.0-8.5 之间洗脱效率较高， ph值低于 7.0 则洗脱效率很低。一般基因组

7、提取试剂盒中的洗脱缓冲液就是 te(ph8.0) ，既为 dna从硅基质膜上洗脱下来提供良好的 ph环境，其中的 edta又能保证 dna 不被 dnase降解，同时由于 edta浓度非常低，对核酸内切酶、 dna 聚合酶的影响非常微弱，不影响后续试验，可放心使用。洗脱液体积：当洗脱液体积小于30ul 时，洗脱效率很低且不稳定；当洗脱液体积在 50-200ul 时，洗脱效率稳定在 80-90 ，并可保证得到最大产量，因此洗脱液体积不能小于 30ul 。5最新 料推荐加洗脱液部位：100-200ul 洗脱液能完全覆盖硅基质膜， dna的洗脱量可得到保证，但当洗脱液体积较少如 30-50ul 时，

8、须在硅基质膜中间部分悬空滴加洗脱液，以确保少量的洗脱液能完全覆盖硅胶膜。洗脱液的温度：在加洗脱液之前，先将洗脱液在 60-75 水浴中预热 10 分钟，可有效提高 dna的洗脱效率。洗脱时间和次数：加入预热的洗脱液后， 可在室温放置 2-5 分钟使 dna完全溶解在洗脱液里通过离心而洗脱下来。 同时可进行二次或三次洗脱， 即将前次洗脱下来的洗脱液再上柱、 离心，使前次没有洗脱下来的 dna再次溶解在洗脱液里，从而提高 dna的产量。5、dna的定量及检测提取得到的 dna片段需从分子质量、浓度、纯度等方面进行检测，从而判断 dna质量。用琼脂糖凝胶电泳分析dna分子质量：得到的基因组 dna片

9、段的大小与样品保存时间、 操作过程中的剪切力等因素有关。 solarbio公司的基因组dna提取试剂盒提取的不同材料基因组 dna片段大小一般在50kb 左右，能很好地满足后续试验的6最新 料推荐要求。通常用琼脂糖凝胶电泳分析 dna分子质量时，以溴酚蓝为示踪染料，eb染色，紫外观察，并与 dna分子量标准对照即可判断所提 dna的平均分子量。高质量的基因组 dna应显示为单一条带， 如 dna降解则表现为弥散条带。用紫外分光光度计检测dna浓度和纯度：浓度测定：dna在 od260处有显著吸收峰， od260值为 1 相当于大约 50ug/ml 双链 dna。以下简单介绍 od260的测定方

10、法：所提基因组 dna样品 =100ul进行od260值测定的待测样品=20ul所提基因组dna样品 +180ulte=200uldna稀释倍数 =200ul/20ul=10倍如 200ul 待测样品 od260值=0.2待测样品浓度 ( 即 100ul 基因组 dna样品浓度 )=50ug/ml od260值稀释倍数 =100 ug/ml所提 100ul 基因组 dna样品总量 =100 ug/ml 100ul=10ug dna纯度测定：一般用 od260/od280值检测 dna样品的纯度。正常 od260/od280值约7最新 料推荐为 1.7-1.9 ，说明 dna纯度较好；若 od2

11、60/od280值小于 1.7 ，说明可能有蛋白污染；若 od260/od280值大于 2.0 ，说明可能有 rna污染或 dna已经降解。注：因为 ph 值和离子会影响光吸收值，因此洗脱时如不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水， od260/od280值会偏低，但并不表示纯度低。6、dna的储存储存溶液：dna为两性解离分子，在碱性条件下较稳定，因此一般用te(ph8.0)保存。te的成分为： 10 mmtris-hcl(tris与盐酸形成强的缓冲对 ) ；1 mmedta(乙二胺四乙酸，能螯合二价金属阳离子，抑制dnase的活性 ) ；ph8.0( 碱性条件可减少 dna的脱氨作用，防止降解 ) 。ddh2o的正常 ph值为 7.0 ，可作为 dna的储存液，但有些试验室制备的 ddh2o呈酸性 (ph 值小于 7.0) ，这不仅影响 dna的洗